韓瑜 葉壯 楊帆 張晶瑩 趙令 于江虹 焦立新

(1長春市中心血站輸血研究所，吉林 長春 130000；2吉林大學第一醫(yī)院風濕免疫科；3吉林省疾病預防控制中心)

骨關節(jié)炎(OA)是人體能動關節(jié)的一種退行性疾病，老年人多見，以關節(jié)疼痛、活動受限等為主要臨床癥狀〔1〕。OA的確切病因未明，以前只是簡單地認為OA是由于關節(jié)磨損而受到的損害，而現(xiàn)在一致認為OA是由局部和系統(tǒng)因素的復雜作用而造成的〔2〕。有文獻報道，OA患者外周血及滑液中調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量變化顯著，Th17和Th1/17細胞數(shù)增多。這說明在OA患者滑膜腔中有免疫細胞的激活〔3〕，免疫因素可能在OA的發(fā)生中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。自然殺傷(NK)細胞是人體重要的免疫細胞，在天然免疫方面起著重要的作用。NK細胞功能的發(fā)揮主要依賴于殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，它通過與靶細胞表面相應的人白細胞抗原(HLA)Ⅰ類分子結合，傳導激活或抑制信號來調(diào)節(jié)NK細胞和部分T細胞活性，在造血干細胞移植、母胎耐受、抗感染免疫及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔4〕。在以往實驗中，我們對吉林地區(qū)的漢族健康人群的KIR及配體的多態(tài)性進行了分析〔5〕，本研究采用PCR-SSP的方法繼續(xù)對吉林地區(qū)的OA患者進行KIR及HLA配體復合體分型，分析并探討免疫因素在OA發(fā)病機制中的作用。

1 對象與方法

1.1試劑與儀器 DNA提取試劑盒(批號：20081410T146，西安天隆科技有限公司)；核酸自動化提取系統(tǒng)(EZBead system-32，美國TBG)；凝膠成像分析系統(tǒng)(JY04S-3C，北京君意東方)；超微量微孔板分光光度計(Epoch，美國Bio-Tek公司)。

1.2研究對象 ①OA組：采集2019年1月至2020年2月吉林大學第一臨床醫(yī)院風濕免疫科門診及住院OA患者135例。男48例，女87例，平均年齡(62.53±5.88)歲。臨床診斷OA患者，均符合2018年中華醫(yī)學會骨科學分會關節(jié)外科學組《骨關節(jié)炎診斷及治療指南》的診斷標準〔6〕，排除合并類風濕關節(jié)炎或其他骨關節(jié)系統(tǒng)疾病病史的患者。②正常對照組：選取同期來自體檢中心年齡相當?shù)?40名健康體檢者作為正常對照組，男45例，女95例，平均年齡(61.77±6.56)歲，均簽署知情同意書。OA組與正常對照組年齡、性別等一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。征其同意后抽取2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，凍存于-80℃冰箱備用。

1.3基因組DNA提取 采用全血基因組核酸提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書，使用核酸自動化提取系統(tǒng)提取基因組DNA。DNA 濃度20～100 ng/μl，A260/A280 為1.7～2.0。

1.4基因分型 KIR基因及HLA配體基因的檢測采用PCR-SSP方法，引物序列、PCR體系和循環(huán)條件參照文獻〔7，8〕。取 10 μl PCR擴增產(chǎn)物加樣于2%瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE 緩沖液中，10 V/cm 電泳 20 min，全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結果。

1.5KIR與HLA配體頻率計算 參照文獻〔9〕方法通過直接計數(shù)計算，頻率(%)=陽性基因數(shù)/研究組總人數(shù)；KIR/HLA 配體復合體的出現(xiàn)頻率按照如下受配體的識別方式進行：KIR2DL1+HLA-C2，KIR2DL2/3+HLA-C1，KIR2DS1+HLA-C2，KIR2DS2+HLA-C1和KIR3DS1+ HLA-Bw4(HLA-A Bw4，HLA-B Bw4T，HLA-B Bw4I)，KIR3DL1+HLA-Bw4(HLA-A Bw4，HLA-B Bw4T，HLA-B Bw4I)。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1KIR基因及HLA配體電泳結果 目的片段大小均與預期結果相符(圖1、2)。

M：Marker; 1～12：2DL4_B,3DL2_A,3DL3_B；2DS2_B,3DP1；2DP1_A,2DS2_A；3DL3A,2DS5_B,3DL2_B；2DS4_B,2DS5_A；2DS4_A,3DL1_B,2DL1_A；2DL3_A,2DS3_A,3DS1_B；2DL3_B,2DL4_A；2DL5_A,2DL5_B,2DS1；3DL1_A,3DS1_A,DRB1；2DS3_B,2DP1_B；2DL1_B,2DL2_A,2DL2_B圖1 KIR 基因的 PCR-SSP 分型結果

M：Marker；1～5：HLA-A Bw4，HLA-B Bw4I,HLA-B Bw4T,HLA-C2,HLA-C1圖2 HLA配體的 PCR-SSP 分型結果

2.2吉林地區(qū)OA組和對照組KIR基因頻率 OA患者中框架基因KIR3DL2、KIR3DL3和KIR2DP1頻率為100%。OA患者中KIR2DL2、KIR2DL5和KIR2DS1基因頻率分別是27.41%、42.96%、41.48%，顯著高于正常對照組的16.43%、30%、29.29%(P<0.05)。其余兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 吉林地區(qū)OA組和正常對照組KIR基因頻率比較〔n(%)〕

2.3吉林地區(qū)OA組和正常對照組HLA配體頻率比較 表2可見，正常對照組HLA-A Bw4的基因頻率顯著高于OA組(P<0.05)。其余HLA配體的基因在正常對照組和OA組中出現(xiàn)頻率較為相近，差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 吉林地區(qū)OA組和正常對照組HLA配體頻率比較〔n(%)〕

2.4吉林地區(qū)OA組和正常對照組KIR/HLA受配體組合比較 由表3可見，KIR3DL1+HLA-Bw4在正常對照組的頻率顯著高于OA組(P<0.05)。KIR3DL1+HLA-A Bw4在正常對照組的頻率，顯著高于OA組(P<0.05)。而其他指標兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 吉林地區(qū)OA組和正常對照組KIR/HLA受配體組合比較〔n(%)〕

3 討 論

OA一直以來被認為是衰老過程中不可避免的現(xiàn)象，直到近期，才明確OA為一種獨立的疾病，是一種與多種因素相關的，發(fā)生在多關節(jié)部位的退行性病變。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在60歲以上的老年人當中膝關節(jié)OA的發(fā)病率，男性為9.6%；女性高達18%〔10〕，但是OA的發(fā)病機制仍然不清，成為國內(nèi)外學者研究的熱點。

KIR的配體主要為HLA-Ⅰ類抗原，不同的KIR受體識別不同人類經(jīng)典MHC-I分子HLA-A，-B和-C〔11〕，并進一步判別對象屬于“自我”或“非我”，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。近年來，在自身免疫性疾病〔12〕、癌癥〔13〕、傳染病〔14〕和移植〔15〕等方面，KIR基因多態(tài)性越來越受到人們的關注。大量文獻報道KIR基因多態(tài)性與多種自身免疫病相關。Yen等〔16〕報道在類風濕血管炎和類風濕關節(jié)炎中，KIR2DS1的頻率顯著升高；Jiao等〔17〕報道HLA-B27陽性患者與HLA-B27陽性對照組比較，KIR2DL1與KIR2DL5基因頻率較高，KIR2DL5基因的頻率高于對照組，同時HLA-Cw*08基因頻率也顯著升高。以上研究顯示，在自身免疫性疾病中存在抑制型KIR基因頻率降低，或(和)活化型KIR基因頻率增高的情況。

本研究發(fā)現(xiàn)OA患者中抑制型KIR2DL2和KIR2DL5基因頻率升高，而活化型KIR2DS1基因頻率也升高，可能因為基因頻率的變化導致NK細胞和部分T細胞抑制型受體和激活型受體之間的平衡受到破壞從而使其活化的域值降低，激活了NK細胞；進一步分析發(fā)現(xiàn)OA組中HLA-A Bw4的基因頻率低于正常對照組，可能由于OA組KIR配體HLA-A Bw4基因水平降低從而使得HLA-A Bw4分子表達下調(diào)，激活了NK細胞；或KIR3DL1+HLA-A Bw4減少，KIR對NK細胞的抑制性減弱，相應的激活型受體增加，從而引起了OA的發(fā)生和發(fā)展。

當然，KIR及配體與OA的關聯(lián)性，還需要進一步增加樣本量進行證實，本研究只是進行了一個初步的探討?？傊?，KIR作為一類重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在機體免疫中發(fā)揮著重要的作用，隨著我們對其結構、功能的深入研究，必將會為臨床治療提供新的免疫靶點。