徐宇琴 陳燕 傅真杰 溫成平 陳宜濤

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

自2019年12月以來，由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在武漢暴發(fā)，目前仍在全球蔓延。該病毒具有極強的傳染性，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，截至2020年11月30日，全球累計COVID-19確診病例超過6 219萬，死亡人數(shù)超145萬。雖然研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與其他冠狀病毒有相似之處，但目前對于SARSCoV-2的致病途徑以及潛在藥物靶點仍缺乏充分了解，也無抗SARS-CoV-2的特效藥物。中醫(yī)藥在COVID-19的治療上全方位地發(fā)揮了重要作用，改善了患者的臨床癥狀，提高了患者存活率。

連花清瘟膠囊由中藥連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦和甘草組成，常用于治療流行性感冒，具有抗炎、止咳化痰、廣譜抗病毒的作用[1]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，連花清瘟膠囊可以抑制SARS-CoV-2的增殖，減少細(xì)胞因子的過度激活[2]，從而能夠明顯緩解COVID-19患者的臨床癥狀。同時，臨床研究表明，連花清瘟膠囊能夠有效緩解COVID-19患者發(fā)熱、乏力、咳嗽等癥狀，減輕肺部炎性損傷，增加COVID-19的治愈率[3]?；谶B花清瘟膠囊確切的基礎(chǔ)實驗和臨床研究證據(jù)，國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)連花清瘟膠囊/顆粒增加治療“新型冠狀病毒肺炎輕型、普通型”的新適應(yīng)證。到目前為止，連花清瘟膠囊抗COVID-19的藥理機制仍不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。基于目前的研究成果，本研究運用公共數(shù)據(jù)庫和高通量技術(shù)分析預(yù)測藥物的藥理學(xué)機制，初步預(yù)測和分析連花清瘟膠囊治療COVID-19的成分、靶點和通路，為后續(xù)有效藥物的研發(fā)提供理論支持。

1 資料和方法

1.1 連花清瘟膠囊活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）檢索連花清瘟膠囊中藥物連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、板藍(lán)根、魚腥草、廣藿香、大黃、薄荷腦、甘草的化學(xué)成分，通過文獻(xiàn)索引查找TCMSP中無記載的石膏、綿馬貫眾和紅景天的化學(xué)成分。通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL）預(yù)測化合物的成藥性。OB是衡量藥物體內(nèi)代謝動力學(xué)過程的重要參數(shù)，能夠有效預(yù)測藥物在體內(nèi)的生物利用度。DL指化合物與已知藥物的相似性，是化合物成藥的評價指標(biāo)。根據(jù)連花清瘟膠囊中成分的數(shù)量及相應(yīng)OB值、DL值，參考其他中藥有效成分篩選條件，最終以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出成藥性較高的化合物。

1.2 藥物作用靶點獲取 通過TCMSP檢索候選化合物的靶點。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（https://sparql.uniprot.org/）中獲取人類基因信息，通過比對人類基因信息，將TCMSP中獲取的靶點名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因名稱。

1.3 COVID-19相關(guān)靶點篩選 在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫（Human Genome Annotation Database，Gene Cards）中檢索COVID-19的相關(guān)靶點，關(guān)鍵詞選擇“novel coronavirus pneumonia”“severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2（SARS-CoV-2）”和“corona virus disease 2019（COVID-19）”，對三個基因集合進(jìn)行整合，并去除重復(fù)基因，得到COVID-19的潛在靶點。

1.4 連花清瘟膠囊治療COVID-19主要靶點篩選 利用Venn在線平臺Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），將藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，找到兩者的共同靶點。將共同靶點導(dǎo)入String在線平臺數(shù)據(jù)庫 （https://string-db.org/），構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。 將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中，使用MCODE插件進(jìn)行基因網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，依據(jù)節(jié)點連接度（degree）、節(jié)點介度（betweenness centrality，BC） 和節(jié)點緊密度 （closeness centrality，CC）這3個網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，篩選出核心靶點，進(jìn)一步對核心靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 連花清瘟膠囊治療COVID-19的功能和通路富集分析 將1.4中篩選得到的核心靶點導(dǎo)入Metascape在線數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），以人類為研究對象，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。設(shè)置P＜0.01，篩選主要的生物功能和通路，采用繪圖軟件GraphPad Prism 7.0將GO功能分析結(jié)果可視化，采用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）將KEGG通路富集分析結(jié)果可視化。

1.6 連花清瘟膠囊主要“有效成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將核心靶點與連花清瘟膠囊中有效成分的靶向關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“有效成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，以degree值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選主要有效成分，即為連花清瘟膠囊治療COVID-19的主要有效成分。

2 結(jié)果

2.1 連花清瘟膠囊活性成分和作用靶點 以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，在連花清瘟膠囊各味中藥中共獲得260個活性成分，其中金銀花23種、連翹23種、廣藿香11種、苦杏仁19種、麻黃23種、魚腥草7種、板藍(lán)根39種、大黃中16種、甘草93種、紅景天3種、綿馬貫眾3種，去除重復(fù)后共得到184種活性成分。根據(jù)所得活性成分，檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，共得到255個作用靶點。見表1。

表1 通過OB和DL篩選出的“連花清瘟膠囊”中的活性成分Tab.1 Active components screened by OB and DL in “Lianhua Qingwen Capsule”

2.2 COVID-19相關(guān)靶點以“Novel Coronavirus Pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索得到438個靶點，檢索“severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2（SARS-CoV-2）”得到237個靶點，檢索“corona virus disease 2019（COVID-19）”得到64個靶點，剔除重復(fù)后共得到587個COVID-19相關(guān)的靶點。

2.3 連花清瘟膠囊治療COVID-19主要靶點 通過Venn在線平臺對連花清瘟膠囊活性成分的255個靶點與COVID-19的587個靶點取交集，共獲得65個共同靶點。見圖1。將所獲靶點導(dǎo)入String平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape分析此PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，經(jīng)計算該網(wǎng)絡(luò)的平均degree為7.2，平均BC值為0.0058，平均CC值為30.74，篩選得到血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、腫瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、 白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等23個靶點的degree值、BC值、CC值均大于該網(wǎng)絡(luò)的相應(yīng)平均值，提示這些靶點可能是連花清瘟膠囊治療COVID-19的核心靶點。

圖1 連花清瘟膠囊活性成分靶點與COVID-19相關(guān)靶點關(guān)系的Venn圖Fig.1 Venn diagram of the relationship between the effective component target of Lianhua Qingwen Capsule and COVID-19 related target

對這23個核心靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有23個節(jié)點，492條邊，節(jié)點大小反映degree值大小變化，節(jié)點越大degree值越大；邊的粗細(xì)反映combined score值大小變化，邊越粗combined score值越大。見圖2。將23個靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，獲得靶點對應(yīng)的蛋白功能。見表2。

圖2 連花清瘟膠囊治療COVID-19靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The diagram of PPI network among targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

表2 連花清瘟膠囊治療COVID-19核心靶點的蛋白功能Tab.2 Protein function of core targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

2.4 連花清瘟膠囊治療COVID-19的功能和通路 GO功能富集分析提示，生物過程（biological process，BP）主要涉及對有毒物質(zhì)、無機物、脂多糖、抗生素、藥物的反應(yīng)，對神經(jīng)元死亡、白細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)，以及外部凋亡信號通路、活性氧代謝等；細(xì)胞組成（celluar component，CC）主要包括膜筏、黏著連接、核被膜、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、質(zhì)膜蛋白復(fù)合體、谷氨酸能突觸和線粒體包膜；而分子功能（molecular function，MF）主要涉及細(xì)胞因子受體、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 活性、腫瘤壞死因子受體、激酶調(diào)節(jié)、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等功能。見圖3。

圖3 連花清瘟膠囊治療COVID-19潛在靶點的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of potential targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

KEGG通路富集分析顯示，連花清瘟膠囊治療COVID-19涉及的通路主要集中于腫瘤和病毒感染通路，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycosylation end product-receptor of AGE，AGE-RAGE）信號通路、南美錐蟲病、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、癌癥通路、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染、EB病毒感染、FoxO信號通路、酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信號通路等。見圖4。

圖4 連花清瘟膠囊治療COVID-19潛在靶點的KEGG富集分析Fig.4 Enrichment analysis of KEGG of potential targets of Lianhua Qingwen Capsule in the treatment of COVID-19

2.5 連花清瘟膠囊“中藥-主要有效成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape匹配核心靶點和連花清瘟膠囊的有效成分，共得到71種有效成分。進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯詃egree值大于均值為標(biāo)準(zhǔn)篩選有效成分，得到22個主要有效成分，其中槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山奈酚、甘草查爾酮A和柚皮素對應(yīng)的靶點數(shù)大于4個，是發(fā)揮抗COVID-19作用的重要有效成分。根據(jù)中藥、有效成分及作用靶點網(wǎng)絡(luò)提示，中藥與主要有效成分及靶點間存在復(fù)雜的多靶點網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，黃色節(jié)點表示中藥，藍(lán)色節(jié)點表示藥物有效成分，紅色節(jié)點表示核心靶點，邊表示有效成分與靶點的相互作用。見圖5。

圖5 “中藥-主要有效成分-核心靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.5 “Active components-core targets” network

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為COVID-19屬于 “濕毒疫”范疇[4-5]，主要證候是濕、熱、毒、虛、瘀，臨床癥狀以發(fā)熱、干咳、乏力為主。臨床研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2主要侵襲肺臟、脾臟、心臟和血管等靶器官[6]，COVID-19患者的病理檢查結(jié)果顯示肺臟和免疫系統(tǒng)為主要受損點[7]。連花清瘟膠囊具有廣譜抗病毒、抗感染、免疫調(diào)節(jié)作用，對多種冠狀病毒感染的病癥均有良好治療作用[8-9]。本研究從連花清瘟膠囊中篩選得到184種活性成分，潛在靶點255個，與COVID-19的交集靶點65個。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鎏崾?，連花清瘟膠囊的活性成分主要通過作用于VEGFA、MAPK3、TP53、IL-6、MAPK1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等23個核心靶點以發(fā)揮治療COVID-19的作用。SARS-CoV-2感染機體后，誘發(fā)過度的自身免疫反應(yīng)，釋放IL-6、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）、TNF-α、單核細(xì)胞趨化因子-1 （monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等大量炎癥因子，導(dǎo)致免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡[10]。因此，抗炎治療是治療COVID-19的重要手段。在核心靶點中，IL-6、TNF、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）等是促炎因子，據(jù)此推測連花清瘟膠囊可能通過抑制SARSCoV-2感染所致的炎癥反應(yīng)來發(fā)揮療效。COVID-19患者會出現(xiàn)心衰、心梗、心律失常等心血管系統(tǒng)并發(fā)癥[11]，VEGFA、IL-6、TNF、IL-10、CC類趨化因子配體2（C-C motif ligand 2，CCL2）等核心靶點又是心血管疾病相關(guān)基因，這提示連花清瘟膠囊還可能在一定程度上治療COVID-19患者心臟、血管等靶器官的損傷。綜上所述，通過對靶點的功能分析，提示連花清瘟膠囊可能通過調(diào)節(jié)靶點炎癥因子表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)；同時通過調(diào)控心血管疾病相關(guān)基因，治療心臟、血管等靶器官的損傷。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，核心靶點涉及最多的疾病信號通路是病毒感染相關(guān)通路，包括卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染、EB病毒感染、單純皰疹病毒感染等信號通路，表明連花清瘟膠囊可能對病毒感染有一定的功效。

針對所篩選的23個核心靶點，本研究進(jìn)一步挖掘出連花清瘟膠囊治療COVID-19的22個主要有效成分?；衔锇悬c分析發(fā)現(xiàn)了6個有效成分對應(yīng)的靶點數(shù)大于4個，分別為槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、山奈酚、甘草查爾酮A和柚皮素。研究已證實，槲皮素和山奈酚能通過調(diào)控MAPK信號通路抑制炎癥反應(yīng)[12-13]；槲皮素、山奈酚和漢黃芩素能顯著抑制STAT3的激活和VEGF的表達(dá)，具有抗炎和調(diào)控血管生成的作用[12-14]；山奈酚可以減低ICAM-1和TNF-α水平，防止動脈粥樣硬化[15]，保護(hù)心血管系統(tǒng)；槲皮素、山奈酚、木犀草素和甘草查爾酮A均能降低促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β的水平，進(jìn)而抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，以減輕炎癥反應(yīng)[12-13，16-17]；柚皮素可顯著減低TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、NF-κB的水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，并能夠有效緩解肺損傷[18]。由上可知，連花清瘟膠囊中篩選出的主要有效成分具有顯著的抗炎作用，可能是干預(yù)COVID-19引發(fā)的炎癥反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上述有效成分廣泛存在于甘草、金銀花、連翹、麻黃、廣藿香、魚腥草、紅景天、板藍(lán)根和大黃9味藥中。連翹、金銀花和紅景天均歸心、肺經(jīng)，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能的功效[19-21]。麻黃歸肺經(jīng)，有抗炎和抑制流感病毒的作用[22]。魚腥草歸肺經(jīng)，具有鎮(zhèn)咳平喘、化痰祛濕、增強機體免疫的功能[23]。甘草與廣藿香歸脾、肺經(jīng)，功效祛濕化濁，能抗炎、調(diào)節(jié)免疫、健脾和改善肺功能[24-25]。板藍(lán)根與大黃分別歸脾經(jīng)和心經(jīng)，能夠抗炎、提高免疫力及保護(hù)心腦血管[26-27]。

連花清瘟膠囊中的石膏為礦物藥，是以無機化合物為主要成分的一類藥物，由于無機化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫中無對應(yīng)靶點，故未將石膏納入成分靶點篩選。石膏被廣泛運用于臨床治療，其主要成分是含水硫酸鈣，還含有少量鋅、鐵、鎂等微量元素。鈣離子是人體內(nèi)含量最多的金屬元素，幾乎參與機體所有的生理活動過程，是維持機體細(xì)胞正常功能非常重要的離子。石膏中所含的部分其他無機元素亦是人體必需的微量元素，這些以鈣離子為主的無機元素是石膏發(fā)揮藥理作用的基礎(chǔ)，也是石膏藥用功效廣泛的原因。研究證實，石膏對炎癥及心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的相關(guān)病癥均具有一定的治療作用[28]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對連花清瘟膠囊的作用機制進(jìn)行分析，結(jié)果表明，連花清瘟膠囊通過綜合調(diào)節(jié)多個靶點，發(fā)揮潛在的治療作用，其作用主要涉及調(diào)控炎癥因子、調(diào)節(jié)心血管疾病的相關(guān)通路、抗病毒等，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路協(xié)同的作用機制。本研究初步闡明了連花清瘟膠囊治療COVID-19的主要有效成分、核心靶點和通路之間的相互關(guān)系，對其治療COVID-19的靶點和通路進(jìn)行了初步預(yù)測和分析，以期為后續(xù)實證研究和藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。隨著對COVID-19致病靶點研究的深入，筆者團(tuán)隊將進(jìn)一步探索連花清瘟膠囊治療COVID-19的作用機制。

（致謝：本文在浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所完成，感謝全體實驗室人員對文章相關(guān)工作的指導(dǎo)和建議!）