閆曉丹
(河南省鄢陵縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,河南 鄢陵 461200)
石榴是漿果類植物,屬于落葉灌木類,依據(jù)果實的顏色和甜度可分為紅籽甜石榴、白籽甜石榴、酸石榴以及觀賞類石榴這4個種類。石榴的原產(chǎn)地是印度西北部一帶,在紀元前進入中國,在中國已有兩千多年的歷史。
石榴有非常豐富的營養(yǎng)價值,果實中碳水化合物、鈣、維生素等物質(zhì)含量較高。果實一般鮮食,市場上也有很多石榴產(chǎn)品,如罐頭、果茶、果酒等。石榴花的周期是3 個月左右,具有較好的觀賞性;葉片對重金屬蒸氣有很強的吸附能力,對凈化空氣有很好的效果;石榴果皮有止血、驅(qū)蟲的作用,在燒傷、細菌性痢疾的治療上也有較好效果,還對消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)有一定抗菌、抗病作用。
石榴生長對土壤要求不高,全國范圍內(nèi)都可種植,既是園林綠化的優(yōu)秀種類,也是不錯的經(jīng)濟作物。主要分布在亞熱帶和溫帶地區(qū),中國南北各地均可栽培,其中以江蘇、安徽、陜西、河南、四川、云南、山東等省較多。目前,石榴已經(jīng)成為農(nóng)民致富的支柱產(chǎn)業(yè)之一。
石榴采用無性繁殖,以保持其優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性和一致性,但傳統(tǒng)的無性繁殖方法繁殖數(shù)量少、速度慢,不能適應現(xiàn)代化生產(chǎn)要求。通過組織培養(yǎng),可以快速大量進行繁殖和推廣,在短期內(nèi)提供大量的無性苗木和脫毒苗木。研究軟籽石榴組織培養(yǎng)方法,可以建立石榴組培快繁體系,為進一步開展倍性育種奠定基礎。
在選擇果樹組織進行培養(yǎng)時,培養(yǎng)基選擇MS 和1/2MS。1/2 MS 培養(yǎng)基主要用于根的培養(yǎng),選擇3%蔗糖、0.7%瓊脂,pH 值范圍在5.6~5.8。曹效東等比較了MS、N6、B5、Read等4 種基本培養(yǎng)基對離體芽存活率的影響,不同基本培養(yǎng)基上離體芽的存活率存在較大差異,以MS 效果最好,B5 次之,N6 和Read 較差。研究結(jié)果顯示,基本培養(yǎng)基的成分和用量比例對離體芽的生長有至關(guān)重要的影響,調(diào)整培養(yǎng)基后離體芽的生存活力有明顯提高,基本培養(yǎng)基的成分和比例直接關(guān)系著離體芽的再生存活效果[1]。
果樹組織基本培養(yǎng)基溫度一般在25~28℃,光照強度在40μmol/m2·s 左右,光照時間每天16 h。光照時長對離體芽的存活有關(guān)鍵作用,光照強度過大會致使離體芽光合作用過快導致枯竭,弱光照射適合7~14 天的離體初期,14 天后可正常光照,7~14 天的培養(yǎng)基溫度在20℃左右為宜[2]。
從鄭州滎陽劉溝村成年軟籽石榴樹上,剪取1 年生休眠(落葉)枝條,長10~15 cm,在清水中浸泡24 h 后,扦插在滅菌后的蛭石中,使其處在20~22℃下,光照16 h,黑暗8 h,在人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng)。當休眠芽陸續(xù)萌發(fā)成幼嫩枝條,取石榴扦插枝上生長出的新梢,用自來水沖洗5~10 次。在超凈工作臺上切取帶芽莖段1.0 cm 左右,用75%乙醇浸泡30 s,用0.1%氯化汞浸泡8~10 min,再用無菌水漂洗材料5~6 次,放入無菌水中待用。
把泰山紅石榴的增殖培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基應用于軟籽石榴,將已滅菌的帶芽莖段接種在MS+6-BA(1.2 mg/L)+IBA(0.1 mg/L)培養(yǎng)基上,每瓶3~5 個外植體,共40 瓶。待培養(yǎng)基中的帶芽莖段長出叢生芽后,將叢生芽由瓶中取出,用解剖刀切取莖2 cm,每段帶4~5 個葉片,接種在MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.1 mg/L)培養(yǎng)基上,在人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng)。
把泰山紅石榴誘導分化培養(yǎng)基應用于軟籽石榴愈傷組織的培養(yǎng),取繼代培養(yǎng)20~30 天的組培苗頂部1~4 葉位,正在伸展或已經(jīng)完全展開的幼嫩葉片,用解剖刀切去葉尖和葉柄,并在葉片中脈處橫切3 刀,但保持葉片完整[3]。然后把刻傷的葉片平鋪在盛有30 mL 分化培養(yǎng)基上,即MS+KT(0.1 mg/L)+6-BA(1.0 mg/L)+GA3(0.5 mg/L),葉背面向下。接種后先在黑暗處理2 周,然后轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為25℃,光照時間16 h/天,光照強度為1500~2000 lx。莖段剪成約1.0cm小段,放置在MS+6-BA(1.2mg/L)+IBA(0.1mg/L)培養(yǎng)基上。
增殖培養(yǎng)條件?;九囵B(yǎng)基為MS,蔗糖30g/L、瓊脂粉6g/L、椰汁200mL/L、pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)基在121℃、131kPa 條件下滅菌20 min。接種完成后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度為(26±2)℃,光周期為光照16 h、黑暗8 h,光照強度為1500~2000 lx。
繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.2 mg/L)+IBA(0.1 mg/L),愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0 mg/L)+KT(0.1 mg/L)+GA3(0.5 mg/L)。
扦插在蛭石中的石榴枝條處在20~22℃的環(huán)境下,光照16 h,黑暗8 h。20 天后休眠芽陸續(xù)萌發(fā)成幼嫩枝條,生長良好,詳見圖1。由此可知,此環(huán)境適合休眠枝條的生長,并能為以后提供大量供試材料。
圖1 扦插枝條
把泰山紅石榴的增殖培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基應用于軟籽石榴在人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng),經(jīng)過20 天后,生長勢良好,詳見圖2、圖3。由此可知,泰山紅石榴的增殖培養(yǎng)體系和繼代培養(yǎng)體系也符合軟籽石榴的增殖培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。
圖2 接種后的莖段
圖3 接種后的叢生芽
把泰山紅石榴誘導分化培養(yǎng)基應用于軟籽石榴愈傷組織的培養(yǎng),經(jīng)過30 天后,生長勢良好,詳見圖4。由此可知,泰山紅石榴誘導分化培養(yǎng)基MS+KT(0.1 mg/L)+6-BA(1.0 mg/L)+GA3(0.5 mg/L)同樣適用于軟籽石榴愈傷組織的培養(yǎng)。此外,葉片經(jīng)過適當?shù)目虃梢钥s短愈傷組織的誘導時間,詳見圖4、圖5。
圖4 經(jīng)過刻傷的葉片
圖5 沒有刻過的葉片
由于植物組織在切割時會分溢一些酚類物質(zhì),接觸空氣中的氧氣后,自動氧化或由酶類催化氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)。這種物質(zhì)會毒害外植體組織,使培養(yǎng)材料生長停止,失去分化能力,最終變褐死亡。
前期接種苗中,此問題比較嚴重。因此,在石榴莖段消毒前用抗氧化劑VC100 mg/L 分別浸泡石榴莖段10 min、20 min、30 min。結(jié)果表明,石榴莖段浸泡10 min 對其褐化程度影響不明顯;浸泡20 min 后其褐化程度減少,且生長良好;浸泡30 min 后,褐化程度減輕,但對苗子有傷害,致使其發(fā)芽速度減慢,詳見圖6、圖7、圖8。
圖6 浸泡10 min
圖7 浸泡20 min
圖8 未浸泡
在前期接種中,組培苗污染較多,可能是材料滅菌不徹底、或者接種方法不當、培養(yǎng)環(huán)境不清潔等原因?qū)е?。在以后的接種中要逐步完善接種方法,嚴格進行無菌操作,保證污染率較低。
后期接種中,出現(xiàn)較多無污染卻不能發(fā)芽的死亡苗,可能是消毒過重導致。隨著溫度變化,氣候室中的組培苗生長加快,很多腋芽已經(jīng)萌發(fā),此時消毒時間過長或者消毒時晃動過猛很容易將已萌發(fā)的腋芽殺死,致使莖段不能萌發(fā)。在今后的試驗中要盡可能縮短75%乙醇的消毒時間,可以縮短為10 s,或只用0.1%氯化汞消毒,減輕對組培苗的毒殺危害。
由于組培苗的褐化現(xiàn)象比較嚴重,在試驗中利用抗氧化劑VC100 mg/L 浸泡20 min,使其褐化程度減輕。今后還有待于探索更好的降低褐化方法。
在誘導葉片的愈傷組織培養(yǎng)中,發(fā)現(xiàn)有一些葉片變黑至死,可能是刻傷過重致使葉片損傷嚴重。在以后的操作中,要注意不能用力過度,但還要保證有刻痕,使其能形成愈傷組織,可以嘗試用解剖針在葉片上輕劃。
休眠枝條扦插在蛭石中,使其處在20~22℃環(huán)境下,光照16 h,黑暗8 h,其休眠芽能萌發(fā)成幼嫩的枝條,且生長良好。石榴莖段在消毒前用VC100 mg/L 浸泡20 min,有利于減輕其褐化程度。在誘導愈傷組織時,適當在葉片上刻傷有利于葉片愈傷組織的誘導。泰山紅石榴的組培體系適合于軟籽石榴的組織培養(yǎng)。以上只是軟籽石榴組織培養(yǎng)的初級階段,今后還要繼續(xù)探索,尋找更利于軟籽石榴組培、快繁的方法。