閆曉丹

（河南省鄢陵縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河南 鄢陵 461200）

一、石榴分布與繁殖現(xiàn)狀

1、石榴的分布

石榴是漿果類植物，屬于落葉灌木類，依據(jù)果實的顏色和甜度可分為紅籽甜石榴、白籽甜石榴、酸石榴以及觀賞類石榴這4個種類。石榴的原產(chǎn)地是印度西北部一帶，在紀元前進入中國，在中國已有兩千多年的歷史。

石榴有非常豐富的營養(yǎng)價值，果實中碳水化合物、鈣、維生素等物質(zhì)含量較高。果實一般鮮食，市場上也有很多石榴產(chǎn)品，如罐頭、果茶、果酒等。石榴花的周期是3 個月左右，具有較好的觀賞性；葉片對重金屬蒸氣有很強的吸附能力，對凈化空氣有很好的效果；石榴果皮有止血、驅(qū)蟲的作用，在燒傷、細菌性痢疾的治療上也有較好效果，還對消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)有一定抗菌、抗病作用。

石榴生長對土壤要求不高，全國范圍內(nèi)都可種植，既是園林綠化的優(yōu)秀種類，也是不錯的經(jīng)濟作物。主要分布在亞熱帶和溫帶地區(qū)，中國南北各地均可栽培，其中以江蘇、安徽、陜西、河南、四川、云南、山東等省較多。目前，石榴已經(jīng)成為農(nóng)民致富的支柱產(chǎn)業(yè)之一。

2、石榴的繁殖現(xiàn)狀

石榴采用無性繁殖，以保持其優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性和一致性，但傳統(tǒng)的無性繁殖方法繁殖數(shù)量少、速度慢，不能適應(yīng)現(xiàn)代化生產(chǎn)要求。通過組織培養(yǎng)，可以快速大量進行繁殖和推廣，在短期內(nèi)提供大量的無性苗木和脫毒苗木。研究軟籽石榴組織培養(yǎng)方法，可以建立石榴組培快繁體系，為進一步開展倍性育種奠定基礎(chǔ)。

二、果樹組織培養(yǎng)的影響因素

1、基本培養(yǎng)基

在選擇果樹組織進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)基選擇MS 和1/2MS。1/2 MS 培養(yǎng)基主要用于根的培養(yǎng)，選擇3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH 值范圍在5.6～5.8。曹效東等比較了MS、N6、B5、Read等4 種基本培養(yǎng)基對離體芽存活率的影響，不同基本培養(yǎng)基上離體芽的存活率存在較大差異，以MS 效果最好，B5 次之，N6 和Read 較差。研究結(jié)果顯示，基本培養(yǎng)基的成分和用量比例對離體芽的生長有至關(guān)重要的影響，調(diào)整培養(yǎng)基后離體芽的生存活力有明顯提高，基本培養(yǎng)基的成分和比例直接關(guān)系著離體芽的再生存活效果[1]。

2、培養(yǎng)條件

果樹組織基本培養(yǎng)基溫度一般在25～28℃，光照強度在40μmol/m2·s 左右，光照時間每天16 h。光照時長對離體芽的存活有關(guān)鍵作用，光照強度過大會致使離體芽光合作用過快導(dǎo)致枯竭，弱光照射適合7～14 天的離體初期，14 天后可正常光照，7～14 天的培養(yǎng)基溫度在20℃左右為宜[2]。

三、突尼斯軟籽石榴扦插枝條組織培養(yǎng)

1、扦插苗和組培苗的培養(yǎng)

從鄭州滎陽劉溝村成年軟籽石榴樹上，剪取1 年生休眠（落葉）枝條，長10～15 cm，在清水中浸泡24 h 后，扦插在滅菌后的蛭石中，使其處在20～22℃下，光照16 h，黑暗8 h，在人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng)。當休眠芽陸續(xù)萌發(fā)成幼嫩枝條，取石榴扦插枝上生長出的新梢，用自來水沖洗5～10 次。在超凈工作臺上切取帶芽莖段1.0 cm 左右，用75%乙醇浸泡30 s，用0.1%氯化汞浸泡8～10 min，再用無菌水漂洗材料5～6 次，放入無菌水中待用。

2、增殖培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)

把泰山紅石榴的增殖培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基應(yīng)用于軟籽石榴，將已滅菌的帶芽莖段接種在MS+6-BA（1.2 mg/L）+IBA（0.1 mg/L）培養(yǎng)基上，每瓶3～5 個外植體，共40 瓶。待培養(yǎng)基中的帶芽莖段長出叢生芽后，將叢生芽由瓶中取出，用解剖刀切取莖2 cm，每段帶4～5 個葉片，接種在MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）培養(yǎng)基上，在人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng)。

3、愈傷組織的誘導(dǎo)

把泰山紅石榴誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基應(yīng)用于軟籽石榴愈傷組織的培養(yǎng)，取繼代培養(yǎng)20～30 天的組培苗頂部1～4 葉位，正在伸展或已經(jīng)完全展開的幼嫩葉片，用解剖刀切去葉尖和葉柄，并在葉片中脈處橫切3 刀，但保持葉片完整[3]。然后把刻傷的葉片平鋪在盛有30 mL 分化培養(yǎng)基上，即MS+KT（0.1 mg/L）+6-BA（1.0 mg/L）+GA3（0.5 mg/L），葉背面向下。接種后先在黑暗處理2 周，然后轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照時間16 h/天，光照強度為1500～2000 lx。莖段剪成約1.0cm小段，放置在MS+6-BA（1.2mg/L）+IBA（0.1mg/L）培養(yǎng)基上。

4、培養(yǎng)條件

增殖培養(yǎng)條件。基本培養(yǎng)基為MS，蔗糖30g/L、瓊脂粉6g/L、椰汁200mL/L、pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)基在121℃、131kPa 條件下滅菌20 min。接種完成后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為（26±2）℃，光周期為光照16 h、黑暗8 h，光照強度為1500～2000 lx。

繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.2 mg/L）+IBA（0.1 mg/L），愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0 mg/L）+KT（0.1 mg/L）+GA3（0.5 mg/L）。

四、培養(yǎng)效果

1、休眠枝條的培養(yǎng)

扦插在蛭石中的石榴枝條處在20～22℃的環(huán)境下，光照16 h，黑暗8 h。20 天后休眠芽陸續(xù)萌發(fā)成幼嫩枝條，生長良好，詳見圖1。由此可知，此環(huán)境適合休眠枝條的生長，并能為以后提供大量供試材料。

圖1 扦插枝條

2、石榴組培苗的增殖培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)

把泰山紅石榴的增殖培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基應(yīng)用于軟籽石榴在人工氣候室內(nèi)進行培養(yǎng)，經(jīng)過20 天后，生長勢良好，詳見圖2、圖3。由此可知，泰山紅石榴的增殖培養(yǎng)體系和繼代培養(yǎng)體系也符合軟籽石榴的增殖培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。

圖2 接種后的莖段

圖3 接種后的叢生芽

3、愈傷組織誘導(dǎo)

把泰山紅石榴誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基應(yīng)用于軟籽石榴愈傷組織的培養(yǎng)，經(jīng)過30 天后，生長勢良好，詳見圖4。由此可知，泰山紅石榴誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基MS+KT（0.1 mg/L）+6-BA（1.0 mg/L）+GA3（0.5 mg/L）同樣適用于軟籽石榴愈傷組織的培養(yǎng)。此外，葉片經(jīng)過適當?shù)目虃梢钥s短愈傷組織的誘導(dǎo)時間，詳見圖4、圖5。

圖4 經(jīng)過刻傷的葉片

圖5 沒有刻過的葉片

4、褐化處理

由于植物組織在切割時會分溢一些酚類物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，自動氧化或由酶類催化氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)。這種物質(zhì)會毒害外植體組織，使培養(yǎng)材料生長停止，失去分化能力，最終變褐死亡。

前期接種苗中，此問題比較嚴重。因此，在石榴莖段消毒前用抗氧化劑VC100 mg/L 分別浸泡石榴莖段10 min、20 min、30 min。結(jié)果表明，石榴莖段浸泡10 min 對其褐化程度影響不明顯；浸泡20 min 后其褐化程度減少，且生長良好；浸泡30 min 后，褐化程度減輕，但對苗子有傷害，致使其發(fā)芽速度減慢，詳見圖6、圖7、圖8。

圖6 浸泡10 min

圖7 浸泡20 min

圖8 未浸泡

五、培養(yǎng)中出現(xiàn)的問題

1、污染

在前期接種中，組培苗污染較多，可能是材料滅菌不徹底、或者接種方法不當、培養(yǎng)環(huán)境不清潔等原因?qū)е隆Ｔ谝院蟮慕臃N中要逐步完善接種方法，嚴格進行無菌操作，保證污染率較低。

2、消毒

后期接種中，出現(xiàn)較多無污染卻不能發(fā)芽的死亡苗，可能是消毒過重導(dǎo)致。隨著溫度變化，氣候室中的組培苗生長加快，很多腋芽已經(jīng)萌發(fā)，此時消毒時間過長或者消毒時晃動過猛很容易將已萌發(fā)的腋芽殺死，致使莖段不能萌發(fā)。在今后的試驗中要盡可能縮短75%乙醇的消毒時間，可以縮短為10 s，或只用0.1%氯化汞消毒，減輕對組培苗的毒殺危害。

3、褐化

由于組培苗的褐化現(xiàn)象比較嚴重，在試驗中利用抗氧化劑VC100 mg/L 浸泡20 min，使其褐化程度減輕。今后還有待于探索更好的降低褐化方法。

4、刻傷

在誘導(dǎo)葉片的愈傷組織培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)有一些葉片變黑至死，可能是刻傷過重致使葉片損傷嚴重。在以后的操作中，要注意不能用力過度，但還要保證有刻痕，使其能形成愈傷組織，可以嘗試用解剖針在葉片上輕劃。

六、結(jié)論

休眠枝條扦插在蛭石中，使其處在20～22℃環(huán)境下，光照16 h，黑暗8 h，其休眠芽能萌發(fā)成幼嫩的枝條，且生長良好。石榴莖段在消毒前用VC100 mg/L 浸泡20 min，有利于減輕其褐化程度。在誘導(dǎo)愈傷組織時，適當在葉片上刻傷有利于葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。泰山紅石榴的組培體系適合于軟籽石榴的組織培養(yǎng)。以上只是軟籽石榴組織培養(yǎng)的初級階段，今后還要繼續(xù)探索，尋找更利于軟籽石榴組培、快繁的方法。