劉 娜，彭丹丹，劉亞楠，王 敏，張明丹，黃繼紅

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

近年來，隨著消費(fèi)者對高糖、高熱量飲食的偏好度持續(xù)走低，低熱量、低糖食品逐漸成為消費(fèi)趨勢。此外，肥胖、糖尿病和齲齒等問題導(dǎo)致消費(fèi)者對蔗糖替代品的需求升高。有研究表明，低糖、低熱量的飲食方式不僅能改善高血脂，降低機(jī)體患糖尿病、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，還有助于維持長時(shí)間的飽腹感和持續(xù)的能量釋放，從而進(jìn)一步影響身體和精神狀況[1-3]，這使得功能性甜味劑得到廣泛關(guān)注。異麥芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-呋喃果糖，Isomaltulose)具有與蔗糖相似的感官品質(zhì)和營養(yǎng)、功能特性，因此，優(yōu)于其他替代性碳水化合物。

異麥芽酮糖作為蔗糖的同分異構(gòu)體，存在于蜂蜜、甘蔗汁等物質(zhì)中[4]，能選擇性促進(jìn)人體腸道內(nèi)雙歧桿菌的生長，具有低熱量、防齲齒、抑制肥胖等功能特性，能很大程度上滿足功能性甜味劑的要求[5]，可供糖尿病患者和肥胖人士食用。異麥芽酮糖可完全水解于人體小腸中，大劑量攝入后無副作用(如脹氣或腹瀉)[6]，食用安全性高，美國FDA將其認(rèn)證為GRAS(公認(rèn)安全)級食品添加劑，2005年被歐盟批準(zhǔn)為新資源食品[7]。目前，異麥芽酮糖可作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，也可作為聚合物和表面活性劑等生物產(chǎn)品的原材料[8]，還可添加于煙草中掩蓋雜味。

1 異麥芽酮糖的物理特性

異麥芽酮糖是一種由葡萄糖與果糖以α-1,6糖苷鍵結(jié)合而成的還原性雙糖，還原性約為葡萄糖的52%，分子式為C12H22O11·H2O，相對分子質(zhì)量為360.32，能產(chǎn)生+97°～98°(αD20)的旋光度[9]。外觀和味道與蔗糖相似，呈白色結(jié)晶，甜度約為蔗糖的42%，不隨環(huán)境變化而改變。溶解度在室溫下僅為蔗糖的50%，溫度升高時(shí)，溶解度急劇增加，80 ℃時(shí)達(dá)到蔗糖的85%。與蔗糖的熔點(diǎn)(160～185 ℃)相比，異麥芽酮糖的更低(123～124 ℃)[10]。異麥芽酮糖還具有高穩(wěn)定性，主要表現(xiàn)：(1)耐酸水解性良好，pH 2.0時(shí)，20%的異麥芽酮糖溶液沸騰1 h也不發(fā)生水解反應(yīng)[11]，因此，在酸性食品中比蔗糖更穩(wěn)定；(2)異麥芽酮糖添加到等滲或低滲飲料中能保持滲透壓的穩(wěn)定；(3)異麥芽酮糖對大多數(shù)細(xì)菌和酵母有抗性[10]，不易被利用，因而添加異麥芽酮糖的產(chǎn)品更易保持甜味。

2 異麥芽酮糖的生物活性

2.1 消化吸收特性

體外研究表明：異麥芽酮糖經(jīng)腸道中的蔗糖酶-異麥芽糖酶復(fù)合催化水解為單糖，由于異麥芽酮糖中存在更強(qiáng)的α-1,6糖苷鍵，導(dǎo)致其雖能在小腸中完全水解，但水解速度慢，僅為蔗糖水解速度的20%～25%[12]。這意味著當(dāng)?shù)攘空崽堑南臀杖客瓿蓵r(shí)，異麥芽酮糖仍在水解，為人體提供葡萄糖和能量。Lina等[13]已證實(shí)異麥芽酮糖的消化吸收可在小腸內(nèi)基本完成。大鼠的體內(nèi)放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)[14]表明，單次口服異麥芽酮糖后，在大鼠尿液和糞便中只檢測到極少量的異麥芽酮糖。因此，異麥芽酮糖既可作為可消化碳水化合物(糖和淀粉：16.74 kJ/g)為人體提供相同能量，也可作為有良好耐受性的食品添加劑應(yīng)用于食品行業(yè)。

2.2 抗齲齒特性

齲齒是當(dāng)人體攝入較多糖分時(shí)，形成牙菌斑的細(xì)菌(如變形鏈球菌)發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸使牙釉質(zhì)中的鈣溶解，從而引起蛀蝕。異麥芽酮糖本質(zhì)上是非致齲性的，這主要?dú)w功于雙糖的高微生物穩(wěn)定性。因其前身蔗糖結(jié)構(gòu)中葡萄糖和果糖分子之間的α-1,2糖苷鍵被酶重排為更加穩(wěn)定的α-1,6糖苷鍵[15]，因此不被口腔微生物(包括致齲細(xì)菌)發(fā)酵利用，即不產(chǎn)生損害牙齒的胞外多糖和酸。使用大鼠模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性齲齒研究證實(shí)了異麥芽酮糖的抗齲齒特性[16]，喂養(yǎng)異麥芽酮糖大鼠的齲齒率顯著低于喂養(yǎng)蔗糖和乳糖的大鼠。

2.3 胰島保護(hù)及對血糖參數(shù)的影響

胰島素在調(diào)節(jié)人體血糖平衡和新陳代謝中起關(guān)鍵作用，它通過“打開”葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的“門”來降低血糖水平[17]。攝入異麥芽酮糖后，由于其水解速度緩慢，使得葡萄糖、果糖的釋放和吸收延遲，導(dǎo)致血糖和胰島素水平的升高速率比蔗糖引起的要慢。

異麥芽酮糖對血糖水平的影響較低，有利于糖代謝和保護(hù)胰島。Maeda等[18]對10位健康男性進(jìn)行攝入研究，對比受試者服用50 g異麥芽酮糖和蔗糖前后血糖指標(biāo)和胰島素的變化，結(jié)果顯示攝入15、30、60 min后，異麥芽酮糖引起的血糖反應(yīng)更平緩，胰島素值更低。此外，糖耐量受損的人定期攝入含異麥芽酮糖的配方奶粉有利于改善代謝綜合征[19]。

2.4 脂肪氧化

異麥芽酮糖不僅能維持血糖穩(wěn)態(tài)，還能保持更高的脂肪氧化率[20-21]，從而減少人體對碳水化合物氧化的依賴。一種添加異麥芽酮糖的配方奶粉具有減肥作用[22]，能更好地抑制餐后血糖水平，減少內(nèi)臟脂肪堆積，這可能是由于異麥芽酮糖刺激了肝臟中的PPAR-α(過氧化物酶體增殖激活受體)和脂肪細(xì)胞PPAR-γ 基因的表達(dá)上調(diào)所致。這種特性使異麥芽酮糖成為糖尿病患者和糖尿病前期疾病(如胰島素抵抗或代謝綜合征)患者以及肥胖人士可以安全食用的糖。

3 異麥芽酮糖的生產(chǎn)方式

由于異麥芽酮糖在自然界中含量低，使用化學(xué)方法合成難度較大，因此，主要利用微生物轉(zhuǎn)化及酶異構(gòu)化蔗糖2種方式生產(chǎn)。其中酶異構(gòu)化蔗糖是一種利用蔗糖異構(gòu)酶(SIase，EC5.4.99.11)催化蔗糖生成異麥芽酮糖的酶促反應(yīng)，具有極大的商業(yè)潛力。

3.1 微生物轉(zhuǎn)化法

早期一般采用微生物轉(zhuǎn)化法來生產(chǎn)異麥芽酮糖，主要包括菌體發(fā)酵轉(zhuǎn)化蔗糖與菌體細(xì)胞固定化兩種方式。迄今已發(fā)現(xiàn)多種微生物能發(fā)酵蔗糖轉(zhuǎn)化異麥芽酮糖，如沙雷氏桿菌屬(SerratiaplymuthicaATCC15928[23])、歐文氏桿菌屬(ErwiniarhaponticiNX-5[24])、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.LX-3[25])等，均有產(chǎn)異麥芽酮糖的能力。

3.1.1 菌體發(fā)酵法

菌體發(fā)酵蔗糖生成異麥芽酮糖的方法實(shí)質(zhì)是靠微生物體內(nèi)表達(dá)的SIase催化蔗糖的轉(zhuǎn)化來完成的?；诰晷再|(zhì)的不同，可將其分為原始菌株發(fā)酵、誘變菌株發(fā)酵及重組菌株發(fā)酵3種。Kawaguti等[26]采用間歇法研究Erwiniasp. D12菌株生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響因素，得出最佳條件下35%的蔗糖溶液轉(zhuǎn)化15 min，即可得到72.11%的異麥芽酮糖產(chǎn)率。Cho等[27]首次從韓國傳統(tǒng)食品大豆醬和酒曲中分離到1株高產(chǎn)異麥芽酮糖的腸桿菌FMB-1菌株，通過PCR證實(shí)腸桿菌FMB-1中存在新的SIase基因，轉(zhuǎn)化蔗糖48 h后主產(chǎn)物為異麥芽酮糖和海藻酮糖，其中異麥芽酮糖占總糖的90%(±4%)。

為得到更高產(chǎn)量的異麥芽酮糖，同時(shí)達(dá)到優(yōu)化產(chǎn)物分離度的目的，考慮改造菌株以提高蔗糖轉(zhuǎn)化率并降低產(chǎn)物黏度。其中誘變是得到性狀優(yōu)良菌株的一種普遍方法。誘變法雖煩瑣耗時(shí)，但易操作、成本低且效益高。合適的篩選方法對獲得目的菌株至關(guān)重要。目前一般采用自動(dòng)化、微型化、高靈敏度的高通量篩選系統(tǒng)，有利于提高篩選效率，增加尋找理想突變體的可能性。全自動(dòng)生長曲線分析儀(Bioscreen C)是一種自動(dòng)化、小型化的系統(tǒng)，能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)量和產(chǎn)物的自動(dòng)分析，但因其規(guī)模小、分辨率低，一般與其他方法結(jié)合形成多層次篩選體系，更利于分離出改良突變體。典型菌株常見的突變及篩選方法如表1所示。

菌株經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件或誘變處理后均能達(dá)到較高蔗糖轉(zhuǎn)化率，但這種菌體發(fā)酵轉(zhuǎn)化蔗糖的方法一般存在生產(chǎn)周期長、發(fā)酵液成分復(fù)雜、分離純化目標(biāo)產(chǎn)物成本高等缺點(diǎn)[33]，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此應(yīng)用較少。實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，多采用代謝工程的手段構(gòu)建SIase生產(chǎn)菌株，這種方法是將某種產(chǎn)異麥芽酮糖菌株中編碼SIase的基因?qū)肓硪环N微生物，再利用工程菌在生長代謝過程中不斷產(chǎn)異麥芽酮糖。目前，最常用作SIase表達(dá)載體的是大腸桿菌(E.coli)。Li等[34]克隆了菌株ErwiniarhaponticiNX-5的SIase基因在E.coli中高效表達(dá)，得到重組菌株轉(zhuǎn)化550 g/L蔗糖溶液90 min后，異麥芽酮糖產(chǎn)率為87%。Zhang等[35]合成來自Erwiniasp. Ejp617的SIase基因，基因組挖掘技術(shù)鑒定為新的SIase基因后，在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)。蔗糖異構(gòu)化反應(yīng)結(jié)果表明，底物濃度300 g/L時(shí)，經(jīng)180 min生物反應(yīng)，獲得240.9 g/L異麥芽酮糖，產(chǎn)率達(dá)80.3%。

在E.coli中異源表達(dá)已得到較高的異麥芽酮糖產(chǎn)量，但存在內(nèi)毒素和細(xì)胞熱原影響產(chǎn)物分離[36]。為避免這個(gè)問題，現(xiàn)有研究將SIase基因?qū)氤鼸.coli外的非侵襲性和非致病性宿主，如Zhang等[37]為生產(chǎn)食品級的異麥芽酮糖并提高產(chǎn)量，將PantoeadispersaUQ68 J的SIase基因在非致病性酵母菌Yarrowialipolytica(解脂耶氏酵母)中超表達(dá)，工程菌S47以600 g/L蔗糖底物濃度發(fā)酵后，異麥芽酮糖最高質(zhì)量濃度達(dá)572.1 g/L，且單糖副產(chǎn)物葡萄糖等轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)脂類，不良化合物產(chǎn)生減少。除Yarrowialipolytica外，也有使用Lactococcuslactis(乳酸乳球菌)[38]、Saccharomycescerevisiae(釀酒酵母)[39]和Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)[40]等作SIase異源表達(dá)的宿主構(gòu)建工程菌。

3.1.2 固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化

固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酮糖的工藝已日趨成熟。與菌體發(fā)酵法相比，固定化細(xì)胞技術(shù)既利于細(xì)胞的循環(huán)使用、增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度，又利于提高蔗糖轉(zhuǎn)化率、降低分離下游產(chǎn)物的成本。用于固定化的載體種類眾多，典型的如海藻酸鈉、殼聚糖、聚乙烯醇等。利用海藻酸鈉作包埋劑，CaCl2作交聯(lián)劑的固定化細(xì)胞穩(wěn)定性好、可操作性強(qiáng)且成本低廉。常用的固定化細(xì)胞的相關(guān)工藝如表2所示。

表2 常用固定化細(xì)胞材料及工藝

3.2 酶催化合成法

微生物轉(zhuǎn)化法中蔗糖底物濃度有限，蔗糖既是SIase的底物又是細(xì)胞生長所需的碳源，即使能轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖，也無法避免細(xì)胞利用產(chǎn)生額外的蔗糖消耗[25]，而且細(xì)胞壁的存在進(jìn)一步增大細(xì)胞傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致反應(yīng)速度大幅降低。此外，這些異麥芽酮糖生產(chǎn)菌株缺乏食品級遺傳背景，各種未經(jīng)認(rèn)證的胞外產(chǎn)物的存在又使異麥芽酮糖的回收過程復(fù)雜化[48]。因此，直接利用SIase進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)更適用于底物濃度較高及發(fā)酵產(chǎn)物難以分離的異麥芽酮糖生產(chǎn)過程。

3.2.1 固定化酶生產(chǎn)異麥芽酮糖

通常來說，野生菌株分泌的SIase活性低，不能滿足異麥芽酮糖的生產(chǎn)。考慮到固定化酶有良好的操作性和存儲穩(wěn)定性，現(xiàn)已嘗試固定化SIase以實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用。Contesini等[49]首次將2種不同的載體——硅藻土(吸附法)和低甲氧基果膠微膠囊(包埋法)用于SIase的固定化，但這2種方法制備的固定化酶穩(wěn)定性差、酶活和蔗糖轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)化率分別為60%和30%。Wu等[50]采用經(jīng) ε-poly-L-lysine修飾的介孔二氧化鈦M-TiO2(EPL-M-TiO2)作為固定SIase的載體，固定后酶活為39.41 U/g，連續(xù)反應(yīng)16批后蔗糖轉(zhuǎn)化率仍保持在95%左右。但這種新型生物材料屬于一種納米晶體，成本過高，不宜用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，選擇一種成本經(jīng)濟(jì)、操作穩(wěn)定性好、酶活力及回收率高的固定化載體勢在必行。

耿夢華等[51]報(bào)道了一種利用天然堿性多糖——?dú)ぞ厶俏⑶驗(yàn)檩d體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用對來源于重組短小芽孢桿菌的SIase固定的方法，最終得到固定化SIase轉(zhuǎn)化蔗糖的產(chǎn)物得率為87.8%，連續(xù)轉(zhuǎn)化16次產(chǎn)物得率無明顯降低。以殼聚糖為載體通過吸附交聯(lián)法制備的固定化酶具有廣闊前景，但這種固定化方法目前僅限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用仍有待研究。

3.2.2 細(xì)胞表面展示系統(tǒng)

異源蛋白質(zhì)在革蘭氏陰性細(xì)菌[52]、革蘭氏陽性細(xì)菌[53]和具有錨定基序蛋白質(zhì)的真菌[54]外膜上的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)已被廣泛關(guān)注。細(xì)胞表面展示系統(tǒng)本質(zhì)上是酶應(yīng)用技術(shù)的延伸，這種技術(shù)的最大特點(diǎn)是微生物細(xì)胞表面酶分子的生成與自固定可同步進(jìn)行，同時(shí)因活體全細(xì)胞生物催化劑易制備，不需進(jìn)一步純化或固定酶，因此極具研究價(jià)值。Zhan等[55]為提高食品級菌株工業(yè)化酶促合成異麥芽酮糖的速率，將蔗糖異構(gòu)酶基因 palI 與分子載體 cotX 構(gòu)建為基因融合體，建立基于枯草芽孢桿菌168孢子的表面展示系統(tǒng)，獲得孢子表面的活性SIase，以UBM(未經(jīng)處理的甜菜糖蜜)和SP(豆粉)為碳源和氮源，在最佳轉(zhuǎn)化條件下，產(chǎn)孢6 h后轉(zhuǎn)化率達(dá)92%。以農(nóng)業(yè)廢料為底物，利用該系統(tǒng)生產(chǎn)異麥芽酮糖不僅能提高SIase酶活性和穩(wěn)定性，有助于克服遺傳背景的問題，還具有成本效益高、環(huán)境友好等特點(diǎn)。這對食品工業(yè)生產(chǎn)異麥芽酮糖和其他工業(yè)生物催化反應(yīng)具有一定的參考價(jià)值。

雖然表面展示系統(tǒng)生產(chǎn)技術(shù)顯現(xiàn)出良好的性能和應(yīng)用前景，但仍存在一些不確定因素影響此技術(shù)的普及：由于膜面積的限制，酶的產(chǎn)生量有限，展示的酶數(shù)量通常在103～104之間[56-57]；部分催化反應(yīng)需要內(nèi)源性輔酶的參與才能進(jìn)行酶促反應(yīng)，限制了酶的種類[58]。因此，開發(fā)工業(yè)化的展示酶技術(shù)，必須考慮酶的種類、結(jié)構(gòu)和應(yīng)用等因素。

4 展望

異麥芽酮糖已被40多個(gè)國家和地區(qū)應(yīng)用于食品、化工、化妝品等行業(yè)，市場需求逐步擴(kuò)大。SIase是利用蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的關(guān)鍵酶，然而，SIase異構(gòu)化蔗糖產(chǎn)物中除異麥芽酮糖外，還存在一些副產(chǎn)物如海藻酮糖、葡萄糖等影響蔗糖轉(zhuǎn)化，無法實(shí)現(xiàn)異麥芽酮糖的連續(xù)高效生產(chǎn)，不能在低成本前提下保證產(chǎn)品純度，為異麥芽酮糖的生產(chǎn)帶來困擾。目前雖有固定化細(xì)胞和酶、基因重組、表面展示系統(tǒng)等方法改進(jìn)異麥芽酮糖的生產(chǎn)方式，但生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)規(guī)模仍有較大提升空間。因此，還可從以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究開發(fā)，以提高異麥芽酮糖的生產(chǎn)水平：(1)選育高產(chǎn)SIase的菌株，可利用傳統(tǒng)誘變方法結(jié)合新型誘變系統(tǒng)如ARTP(常壓室溫等離子體誘變)等手段，篩選出底物專一性強(qiáng)、酶活性高的菌株。(2)鑒于異麥芽酮糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用，研究SIase在食品級微生物中的異源表達(dá)，尤其是表面展示系統(tǒng)及展示表達(dá)后的產(chǎn)物分泌具有重要意義。(3)進(jìn)一步優(yōu)化異麥芽酮糖的生產(chǎn)條件，加強(qiáng)下游工藝的研究，開發(fā)低成本、高效率的分離純化技術(shù)。