施寧雪，靳晶豪，陳孝仁*

(揚州大學 園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009)

自1983年引入經(jīng)典的聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)方法以來，核酸擴增技術已經(jīng)滲入到生命科學的各個領域當中[1]。普通的PCR技術需要通過連續(xù)的溫度變化(變性、退火與延伸)來實現(xiàn)核酸的擴增，而這些繁瑣的變化過程需要借助于如PCR儀這樣精密的循環(huán)儀器，這便將實驗限制在傳統(tǒng)實驗室內。自1990年以來，大量的等溫核酸擴增技術得到應用，如環(huán)介導等溫擴增技術、單鏈置換擴增技術[2]、多重鏈置換擴增技術、滾環(huán)擴增技術[3]、依賴解旋酶的擴增技術[4]、基于核酸序列的擴增技術以及重組酶聚合酶擴增技術[5]等，這些等溫核酸擴增技術與基于PCR的核酸擴增技術相比，具有特異性高、靈敏度強、操作簡單、反應時間短、不需要特殊儀器且反應最佳溫度適中(37～42 ℃)等優(yōu)點。

其中值得注意的一項技術是RPA (Recombinase polymerase amplification，重組酶聚合酶擴增)技術。它由Piepenburg等[6]于2006年開發(fā)，雖引入時間較晚，但其具有的多項優(yōu)點使得檢測操作可以在現(xiàn)場進行，而不是僅限于實驗室內，因而迅速得到大眾的青睞。2014年，由英國Twist DX公司推出的商業(yè)化RPA試劑盒使檢測更加方便，同時結合多種探針，擴大了RPA技術的應用范圍[7]。本文對RPA技術的原理、應用及其發(fā)展前景等進行綜述。

1 RPA技術介紹

1.1 反應原理

該技術的反應原理如圖1所示。RPA反應主要依賴來源于T4噬菌體的重組酶UvsX和重組酶負載因子UvsY(輔助蛋白)、單鏈結合蛋白(Single-stranded DNA-binding protein, SSB) Gp32、鏈置換DNA聚合酶Bsu (BacillussubtilisPol)或Sau (StaphylococcusaureusPol)，然后以T4噬菌體核酸復制機制為原理實現(xiàn)模板的擴增。首先，在ATP (Adenosine triphosphate)的參與下引物與重組酶UvsX形成核蛋白絲復合物，該復合物在目標雙鏈DNA中雙向掃描尋找同源序列，一旦找到同源序列，重組酶會將此位置的雙鏈DNA解離，并形成D環(huán)結構；此時的D環(huán)一側為雙鏈，發(fā)生鏈置換反應，而另一側為單鏈，由SSB蛋白Gp32穩(wěn)定；然后核蛋白絲復合物主動水解ATP使其構象發(fā)生變化，重組酶解離后引物3’端暴露，此時DNA聚合酶Bsu與引物3’ 端結合，DNA擴增反應啟動形成新的互補鏈。在這個反應中，正向引物和反向引物分別介導的反應過程是同時進行的，新形成的單鏈與原始鏈互補配對，形成完整的擴增子代。擴增子代會不斷重復此步驟，擴增產物成指數(shù)型增長，整個過程一般在20 min內即可完成。反應中由于SSB蛋白與UvsX之間存在引物結合位點的競爭，而UvsY輔助蛋白能夠侵入SSB蛋白覆蓋的引物，從而阻止SSB蛋白與引物結合所發(fā)生的重組現(xiàn)象并可促進UvsX與引物的結合[6,8]。

1.2 引物設計原則

(1)與普通PCR相比，RPA反應所需引物相對較長，一般在30～35 bp，過短會影響重組酶的生物活性，過長則會增加形成二級結構的可能性；

(2)引物的GC含量在30%～70%，避免形成二級結構與發(fā)卡結構等；

(3)引物5′ 端的前3～5個核苷酸避免出現(xiàn)連續(xù)的鳥嘌呤，最好是胞嘧啶，能促進重組；

(4)引物3′ 端的后3個核苷酸最好是胞嘧啶和鳥嘌呤，有助于提升聚合酶的穩(wěn)定性；

(5)避免出現(xiàn)回文序列和連續(xù)重復等特殊序列[9,10]。

2 RPA技術產物的檢測方式

2.1 瓊脂糖電泳凝膠檢測法

最初采用此方法檢測RPA擴增產物。除了需要添加重組酶、單鏈結合蛋白與DNA聚合酶之外，其余成分與普通PCR相同。通常在37 ℃條件下反應20 min即可獲得大量目的片段。由于反應液中的酶類、蛋白以及擁擠試劑(crowding agents)會影響目的片段在瓊脂糖凝膠中的遷移[11]，因此首先需要通過去污劑或DNA純化試劑盒對擴增產物進行純化處理后方可進行凝膠電泳檢測，最后在凝膠成像儀下對目的條帶進行檢測。雖然該方法操作難度低，且僅需要一對引物即可完成，但電泳凝膠檢測延長了整個檢測時間。

2.2 實時熒光定量檢測法

該方法是目前檢測RPA產物最常見的方法。相比于基礎的RPA反應體系，實時熒光定量檢測法需在RPA擴增體系中加入一個核酸外切酶Ⅲ (Exonuclease Ⅲ，EXO)和exo探針，繼而可通過熒光信號的變化實現(xiàn)模板擴增的實時檢測。探針長45～52 bp，兩側分別攜帶一個熒光基團和一個淬滅基團，中間為無堿基位點，可以是四氫呋喃(Tetrahydrofuran, THF)或dSpacer，在探針的3′末端有阻斷劑，防止聚合酶從末端延伸。當探針完整時，熒光微弱；當無堿基位點被核酸外切酶切開時，淬滅基團被釋放，熒光基團熒光強度增強，此時模板的實時擴增即被檢測到[12,13]。

2.3 側流層析試紙條檢測法

與其他檢測方法相比，側流層析試紙條檢測法(Lateral flow dipstick-RPA, LFD-RPA)的檢測儀器小巧，方便攜帶。該方法將免疫技術、分子雜交技術、膠體金標記技術以及側流層析技術結合于一體，利用三明治夾心法進行檢測。相比于基礎的RPA反應體系，LFD-RPA擴增體系中需要加入一個核酸外切酶Ⅳ (Endonuclease Ⅳ, NFO)、nfo探針和帶有地高辛或生物素標記的反向引物。探針長46～52 bp，5′端標記熒光基團，3′端磷酸化處理，中間有一個無堿基位點。首先擴增產物被生物素標記，然后與熒光基團標記的特異性探針雜交。核酸外切酶Ⅳ切開nfo探針的無堿基位點，產生自由的羥基端與DNA聚合酶結合啟動延伸，形成帶有探針熒光基團與生物素的雙標記擴增子。然后利用側流層析試紙條對擴增產物進行檢測[12,13]。

試紙條上有一條含有生物素抗體的檢測線與一條含有固定抗體的對照線。當擴增子的熒光基團FAM(6-carboxy-fluorescein)與FAM抗體的金標物結合形成免疫復合物時，免疫復合物由于層析作用會向下擴散，首先流經(jīng)檢測線，擴增目的片段中的生物素標記會與檢測線中的生物素抗體結合顯色。之后流經(jīng)對照線，會與對照線上的特殊抗體結合顯色。此反應一般在37～39 ℃條件下進行，5～15 min就可以完成檢測，且檢測結果肉眼直接可判，適用于現(xiàn)場檢測[14]。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附技術檢測法

酶聯(lián)免疫吸附技術(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測法利用抗原和抗體的特異性反應，將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，從而進行定性和定量檢測。通過探針與標記產物的特異性結合，用比色免疫分析法進行分析。該技術綜合了RPA和ELISA兩種技術的特點，不僅在特異性、靈敏度方面表現(xiàn)出較大優(yōu)勢，還操作簡單，不需要熱循環(huán)與產物純化等過程[13]，可在短時間內檢測大量樣品，適用于資源匱乏的現(xiàn)場檢測。

2.5 PCR檢測法

DNA提取時間較長，而且有時也會產生擴增抑制劑影響實驗結果。在RPA-PCR檢測法中，RPA引物能夠直接從簡單處理過的植物中擴增靶標和一些側翼區(qū)域，再利用PCR引物直接從RPA反應中以指數(shù)形式擴增目標。該方法可以降低反應速率，促進靶標的擴增[15]。

3 RPA技術的應用

隨著RPA技術的發(fā)展，在食品安全監(jiān)測、人畜病害防治、植物病害診斷等方面開始采用RPA技術進行相關檢測，出現(xiàn)了大量的應用報道。

3.1 在食品安全方面的應用

Lutz等[16]最早將RPA與離心微流控盒相結合，用于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)耐藥基因(mecA)的全自動分析，引起食品安全研究者的注意。此后該技術不斷應用于食源性病毒、食源性致病菌、轉基因植物等方面的檢測，為食品安全領域的檢測提供了新的思路。

3.1.1 食源性病毒的檢測 食源性病毒指的是以食物為載體，導致人類疾病的病毒，包括以糞-口途徑傳播的病毒或者是以畜產品為載體傳播的病毒。只要有微量的食源性病毒即可導致機體發(fā)病。PCR技術可以檢測出此類病毒，但由于耗時較長、需要特殊的儀器設備等不適用于現(xiàn)場檢測，而RPA技術的出現(xiàn)則解決了這一難題，使檢測該類病毒變得更快、更便捷且準確性高。Liu等[17]將口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的3D基因作為RPA的靶標序列，運用側流層析RT-RPA技術在15 min內通過手心加熱成功檢測出該病毒，靈敏度與實時RT-PCR相同，并且與經(jīng)典豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2和偽狂犬病病毒等無交叉感染。Gao等[18]以豬肝為研究對象，建立了用于檢測基因型4的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)的實時熒光定量逆轉錄結合重組酶聚合酶擴增技術(Quantitative real-time reverse transcription combining recombinase polymerase amplification assay, qRT-RPA)方法，與qRT-PCR相比，兩者檢測限相同，然而后者耗時60 min，前者只需 3 min，且前者回收率比后者高，為室外HEV的檢測提供了快速方法。在樣品制備和處理步驟中存在或可能引入了許多物質(例如抑制劑)，會干擾核酸擴增，當RPA反應體系中這些物質較多時反應會被強烈抑制。針對此問題，Ahmed等[19]優(yōu)化了反轉錄重組酶聚合酶擴增技術(Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)，檢測出H5N1禽流感病毒；Moore等[20]也利用RT-RPA檢測出諾如病毒Gll.4。

3.1.2 食源性致病菌的檢測 食源性致病菌是指以食品為傳播媒介，可以引起食物中毒的致病性細菌，直接或間接污染食品及水源，人經(jīng)口可感染，從而導致食物中毒。食源性致病菌的樣品處理通常需要冗長的富集步驟，對于生長緩慢的致病菌而言，需要的時間更長，而RPA技術能夠快速檢測出致病菌，提高了檢測效率。Hice等[21]使用磁性離子液能夠快速濃縮和提取沙門氏菌(Salmonella)，為RPA檢測提供了致病菌的富集方法。Li等[22]基于LFD-RPA，利用沙門氏菌特有的fimY基因[23]作為靶基因，在短時間內能夠用肉眼直接觀察到檢測結果。Wang等[24]通過改進LFD-RPA系統(tǒng)，在基因組上設計引物對，檢測單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，能消除引物二聚體的假陽性信號，為檢測其他病原體提供了方法。Maestu等[25]首先利用免疫磁分離技術進行樣品的預處理，然后用qRPA (Real-time recombinase polymerase amplification)來檢測李斯特菌，該方法既可以從復雜的食品基質中分離和濃縮出不同的病原體，去除抑制性化合物，也可以降低背景微生物的發(fā)生率。Hu等[26]基于LFD-RPA技術能夠快速檢測出生牛乳樣品中的大腸桿菌(Escherichiacoli) O157∶H7，具有很高的靈敏度。除此之外，RPA技術還可用于副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[27]、金黃色葡萄球菌[28]、克羅諾桿菌(Cronobacter)[29]、布魯氏菌(Brucella)[30]、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)[31]等的檢測。

3.1.3 轉基因植物及其產品的檢測 目前，轉基因技術正快速應用于作物遺傳育種，導致越來越多的轉基因植物和食品流向市場，快速識別轉基因植物及其產品需要合適的檢測技術。RPA技術憑借自身優(yōu)勢被優(yōu)先選用于轉基因食品的檢測。Wang等[32]以GTS 40-3-2大豆為研究對象，開發(fā)了一種簡單可視、基于體熱孵育的RPA檢測技術，利用NaOH方法提取大豆DNA后，再用手心溫度進行孵育，然后加入熒光染料，最后在紫外線工具照射下即能目測熒光結果。Xu等[33]根據(jù)花椰菜花葉病毒35S啟動子和根癌農桿菌胭脂堿合酶基因(NOS)終止子的調控序列，設計了兩組RPA引物，并建立了用于轉基因作物篩選和檢測的實時RPA檢測方法。Li等[34]應用熒光RPA技術，研發(fā)出了轉基因玉米Bt11的快速檢測方法，根據(jù)Bt11外源插入DNA以及插入位點旁側序列設計RPA引物及探針，可以特異性區(qū)分出轉基因玉米品系。此外，RPA檢測方法也用于轉基因水稻[35]、大豆[36]、棉花[37]等的檢測。

3.1.4 其他方面的檢測 除了上述類型的應用之外，其他與食品相關的檢測也運用了RPA技術。如：Santiago等[36]還將ELISA技術與RPA技術結合，應用于過敏源(如榛子、花生、大豆、番茄和玉米)的檢測。Jauset等[38]以羽扇豆過敏源β-粘連蛋白為研究對象，創(chuàng)新建立了適體重組酶聚合酶擴增(Aptamer-recombinase polymerase amplification, Apta-RPA)的檢測方法，使用針對β-粘連蛋白的第二種適體(β-conglutin binding aptamer II, β-CBAII)，利用適體親和力和特異性，將β-CBAII用于快速檢測β-粘連蛋白，為檢測食品中過敏源提供了新的思路。Cao等[39]使用SYBR Green I熒光染料與RPA技術，在37 ℃的條件下，可以有效、快速地識別出摻入羊肉和牛肉的1%豬肉，并且結果可視化，可用于肉類摻假的檢測。

3.2 在人畜病害方面的應用

自Euler等[40]用RPA檢測出土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)后，該技術漸漸廣泛應用于導致人畜病害的病毒、細菌、寄生蟲等方面的檢測，有力地推動了人畜病原體的現(xiàn)場檢測工作。

3.2.1 病毒的檢測 病毒病的暴發(fā)會對人畜造成巨大的傷害，因此在造成損失前檢測出這些病毒至關重要。RPA技術可用于多種病毒的即時檢測且無交叉感染。Zhang等[41]首次建立了登革熱病毒(Dengue virus, DENV)的RT-LFD-RPA檢測法，能同時檢測4種血清型的登革熱病毒，具有較好的重復性，檢測限都低于10拷貝/反應。Li等[42]使用引物和exo探針快速實時檢測了反芻獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)，與實時RT-PCR的靈敏度相同，與PPR的4個譜系都沒有交叉反應，特異性較高。Kong等[43]通過生物傳感器集成的可穿戴微流控設備，用手腕溫度可進行人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)DNA的RPA擴增，再借助手機的熒光檢測系統(tǒng)，在24 min內即可完成檢測，適用于有限環(huán)境資源中的HIV即時檢測。Nybond等[44]將等溫擴增人腺病毒(Human adeno virus，HADV) DNA與紙基垂直微流控裝置(Paper-based vertical flow microarray，VFM)結合，能減少分析物在轉移過程中受到的阻礙，接著利用功能化金納米粒子對擴增子進行比色檢測，且該裝置能夠重復利用，適用于即時診斷。劉文俊等[45]首次建立了動物A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)的LFD-RPA檢測方法,該方法不依賴任何儀器設備，操作簡單、快速，可為基層實驗室臨床快速檢測和流行病學研究提供幫助。目前RPA技術還適用于猴痘病毒(Monkeypox virus)[46]、新城疫病毒(Newcastle disease virus)[47]、鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus)[48]、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus)[49]、犬細小病毒(Canine parvo virus)[50]等的檢測。

3.2.2 細菌的檢測 RPA技術與其他多種方法結合，可更好地實現(xiàn)樣品的處理和信號擴增，有效減少實驗步驟和時間。Higgins等[51]通過結合內部擴增對照模板，利用雙重RPA能檢測出肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)，并成功展示了雙重RPA測定法的臨床診斷實用性。Chen等[52]開發(fā)了用于檢測尿液中銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)等的碟式RPA芯片，可同時檢測兩個樣本，加快了尿路感染病原菌的診斷。由于疊氮溴化丙錠可以穿過死亡細菌細胞膜并在強光下與DNA結合，Chen等[53]用疊氮溴化丙錠RPA法，消除了從死細胞中提取的DNA對檢測結果的影響，在20 min內能夠檢測到化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)和無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)。Saxena等[54]對鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiamallei)進行了LFD-RPA檢測，具有較高的靈敏度，對于早期及時控制、治療人類和動物疾病至關重要。除此之外，RPA也成功運用于鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)[55]、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)[56]、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)[57]、潰瘍分枝桿菌(Mycobacteriumulcerans)[58]、胞內勞森菌(Lawsoniaintracellularis)[59]等的檢測。

3.2.3 寄生蟲的檢測 由于大多數(shù)寄生蟲體積較小，甚至用顯微鏡觀察都不夠清晰，而利用不同的探針、引物設計，RPA技術能準確檢測出這些寄生蟲。Cui等[60]利用LFD-RPA成功檢測到犬類血液中的吉氏巴貝斯蟲(Babesiagibsoni)，靈敏度是常規(guī)PCR的20倍。Crannell等[61]開發(fā)了多重RPA方法，從糞便樣品中提取寄生蟲的DNA后，能夠同時檢測出賈第鞭毛蟲(Giardia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)和阿米巴蟲(Entamoeba)，也可以通過重新設計引物和探針序列檢測出其他多種靶標寄生蟲。Lalremruata等[62]通過RT-RPA檢測到低密度的惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)，與LAMP和普通PCR相比，具有高度準確性和靈敏度，對于防止該類疾病的傳播具有重要意義。Gunaratna等[63]在提取杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani) DNA時加入了磁珠，隨后與RPA檢測技術結合，大大縮短了實驗時長，適合于現(xiàn)場檢測。RPA不僅能檢測以上寄生蟲，還應用于日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)[64]、弓形蟲(Toxoplasmagondii)[65]、呂氏泰勒蟲(Theilerialuwenshuni)[66]、克魯氏錐蟲(Trypanosomacruzi)[67]等的檢測。

此外，RPA技術還應用于立克次體[68]、支原體[69]、癌癥[70]、等位基因[71]等方面疾病的快速檢測。

3.3 RPA技術在植物病害診斷方面的應用

自Zhang等[72]首次應用RPA檢測李痘病毒(Plum pox virus, PPV)以來，該技術獲得了植物病害研究者的關注，將其用于病毒、細菌、真菌、線蟲等病原物的檢測，促進了植物病害診斷工作的順利開展。

3.3.1 植物病毒的檢測 常規(guī)的植物病毒病診斷主要依賴病害癥狀的觀察和核酸、血清學等技術手段?，F(xiàn)有環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、PCR等核酸方法可以檢測植物RNA和DNA病毒，與這些方法相比，RPA檢測法無需高溫變性，且僅需兩個引物即可完成擴增，檢測更方便。Jiao等[73]應用RT-RPA技術快速檢測出辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)，此方法特異性高，不與馬鈴薯Y病毒、番茄斑點枯萎病毒和煙草脈帶花葉病毒等相關病毒發(fā)生交叉反應，并且其靈敏度比常規(guī)RT-PCR方法高約10倍。Ivanov等[74]通過調整底物濃度、組分混合順序和反應溫度等，成功檢測出馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX)，且靈敏度是傳統(tǒng)側流層析技術的260倍，也適用于多種RNA病毒的檢測。Kumar等[75]從粗提取液中有效檢測出柑橘黃化花葉病毒(Citrus yellow mosaic virus, CYMV)，建立了檢測該病毒的免疫捕獲RPA方法，該方法可作為檢疫和芽接過程中的有效病毒檢測技術。Wang等[76]通過RPA和金納米粒子(AuNP)探針相結合的可視化DNA診斷方法，在20 min內能夠檢測到番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)，提供了高度敏感和穩(wěn)定的DNA診斷技術。此外，RPA技術還用于檢測玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus)[77]、菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus)[78]、櫻桃病毒(Cherry virus A)[79]、香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus)[80]、蘋果莖溝病毒(Apple stem pitting virus)[81]等。

3.3.2 植物病原細菌的檢測 經(jīng)驗豐富的研究人員能夠通過觀察植物細菌病害的典型癥狀來診斷植物病害，并通過在專門的培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)來鑒定病原物，該方法大多數(shù)時候是準確的，但是耗時較長。與之相比，RPA技術可以快速準確地檢測出病原物，并且整體檢測成本較低。Scherer等[82]利用RPA技術檢測出導致番茄細菌斑點病的多種病原菌(Xanthomonasgardneri,X.euvesicatoria,X.perforans和X.vesicatoria)?；诟涕冱S龍病菌(Candidatusliberibacterasiaticus,CaLas)的16S rRNA基因，Ghosh等[83]優(yōu)化了反應溫度和時間，建立了一種靈敏可靠的黃龍病LFD-RPA技術。Lau等[84]以丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)感染的植物樣品為研究對象，基于固相載體可逆化固定法，從植物樣品中提取總基因組DNA，通過RPA快速等溫擴增靶病原體DNA序列，隨后與金納米顆粒DNA標簽雜交，再使用鏈霉親和素包被的磁珠富集產物，最后用差分脈沖伏安法進行基于金納米顆粒的電化學評估，能夠靈敏地檢測到植物病原菌DNA，比傳統(tǒng)的PCR、電泳凝膠檢測法靈敏10000倍。Ahmed等[85]直接利用被感染的植物材料，而無需進行DNA的分離，通過LFD-RPA技術檢測出26種果膠桿菌(Pectobacteriumspecies)和12種非果膠桿菌，未出現(xiàn)假陽性或假陰性結果，表現(xiàn)出較高的特異性。

3.3.3 植物病原真菌的檢測 RPA技術具有高度特異性，可以克服植物病原真菌檢測中樣品交叉污染造成的影響。Lau等[86]以被感染的番茄和擬南芥為研究對象，通過在納米金顆粒表面涂覆拉曼報告子和DNA探針，制備了表面增強拉曼散射(Surface-enhanced raman scattering, SERS)納米粒子，隨后與RPA技術結合，進一步開發(fā)了反應快速、特異性強且靈敏度高的即時單管RPA/SERS測定法，用于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等真菌的多重檢測。Burkhardt等[87]應用RPA技術檢測出菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)，在200多種染病草莓上進行了驗證，為草莓和土壤中的菜豆殼球孢檢測提供了新的方法。Austin等利用凍干試劑檢測了橡樹疫霉(Phytophthoraramorum)。Yu等[88]利用LFD-RPA技術快速檢測辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)，可以在5 min內獲得可擴增的DNA，該測定法有望作為診斷試劑盒得到進一步開發(fā)，用于現(xiàn)場或資源有限的實驗室的病樣檢測。Dai等[89]使用一對引物PSYPT-F和PSYPT-R擴增大豆疫霉(Phytophthorasojae)Yptl基因的特定片段，通過對多種卵菌和真菌的測試，驗證了該方法具有較高的特異性。Mustafa等[15]將RPA與PCR技術藕聯(lián)，通過放大疫霉屬中高度保守的atp9～nad9序列間的間隔子，成功檢測出草莓疫霉(Phytophthorafragariae)。RPA技術不僅能夠檢測以上病菌，還能檢測出油菜莖基潰瘍菌(Leptosphaeriamaculans)[91]、草坪草根部感染的真菌(例如Gaeumannomycesavenae,Magnaporthiopsispoae和Ophiosphaerellakorrae)[92]、冬生疫霉(Phytophthorahibernalis)[93]、致病疫霉(Phytophthorainfestans)[94]等。

3.3.4 植物線蟲的檢測 利用經(jīng)典形態(tài)學方法準確鑒定根結線蟲的種類對檢測人員技術水平要求較高，而同工酶表型分析和常規(guī)分子鑒定通常需要使用先進的儀器和軟件，因而使得線蟲的現(xiàn)場檢測具有一定難度。目前RPA技術逐漸用于檢測線蟲，但相關報道較少。Chi等[95]通過LFD-RPA檢測發(fā)現(xiàn)爪哇根結線蟲(Meloidogynejavanica)的純化基因組DNA的檢測限為1 pg，其靈敏度約是常規(guī)PCR檢測的10倍。Cha等[96]從松木中快速提取出松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)基因組DNA，然后利用帶有光學傳感器的電池固定式恒溫裝置，獲取來自RPA反應的熒光吸收，在25 min內可完成檢測。RPA技術有望為線蟲提供一種高效快捷的檢測方法。

4 RPA的技術特點

與傳統(tǒng)PCR技術相比，作為一種新型的核酸擴增技術，RPA具有以下優(yōu)點：

(1)反應可以在恒溫條件下進行。與普通PCR不同，RPA技術利用了生物酶的活性，不需要經(jīng)過一系列的高溫變化過程，整個擴增過程可以在37～42 ℃的恒溫條件下進行。

(2)耗時短。與其他多種擴增技術相比，RPA的顯著特點就是可以在5～20 min內完成檢測。

(3)操作簡單。已經(jīng)開發(fā)出的各類RPA試劑盒便于操作。例如，RPA TwistAmp?Basic 試劑盒的基礎反應體系含有DNA擴增所需的各類試劑，只需要加入引物與模板即可進行檢測[97]。RPA技術有多種檢測方式，如在上述體系中加入探針就可以實現(xiàn)實時熒光定量RPA，在RPA TwistAmp?Basic RT中添加逆轉錄酶，也可以對RNA模板進行擴增。

(4)靈敏度高。在不需純化和富集樣品的條件下，RPA可以檢測低至幾個拷貝的核酸模板。

除了以上幾種優(yōu)點外，RPA技術也具有以下幾種缺點：

(1)RPA產物在使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測時首先需要純化，否則易造成拖帶。

(2)RPA產物在使用側流試紙條進行檢測時，需先將產物稀釋從而使層析效果更佳，也能避免非特異帶影響。

(3)目前沒有專門設計RPA引物和探針的軟件。

(4)由于RPA反應的最適溫度在37～42 ℃，若是同時進行大量樣品的檢測，沒有辦法準確控制每個擴增循環(huán)的起點[98]。

5 展望

RPA技術作為一種新型的檢測技術，在公共衛(wèi)生的現(xiàn)場檢測、食品安全檢測、植物病害診斷等方面顯示出巨大的應用潛力。所有的等溫擴增方法都存在著3個重要的步驟，即樣品制備、擴增和檢測，當然RPA技術也不例外。由于該技術問世才10多年，體系尚不夠成熟，在上述3個環(huán)節(jié)中都存在諸多不足，有待進一步改進。首先，在樣品制備方面可以關注在樣品制備中能否做到濃縮以及進一步的樣品純化，使得實驗簡化、結果準確。其次，RPA技術的一個大難題就是引物的設計，目前沒有專門的引物設計軟件，大多數(shù)實驗中用到的引物可能還是傳統(tǒng)PCR中所使用的，可能會帶來實驗的誤差[99]。最后，在RPA的檢測技術方面，目前已經(jīng)有傳統(tǒng)的電泳凝膠法、實時熒光定量、側流層析等多種方法可以使用，在未來是否可以將RPA技術與其他技術結合用于檢測，或是開發(fā)其他材料使檢測成本更低，這也有待進一步的開發(fā)。相信隨著對RPA技術的深入研究，日趨成熟的RPA技術未來一定能夠更好地發(fā)揮它的作用。