冷 彥，趙 艷，王 靜，沈曉靜，陳立佼，陳亞平，楊賀凱，王白娟*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學，云南 昆明 650201；2.云南省有機茶產(chǎn)業(yè)智能工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省高校智能有機茶園建設(shè)重點實驗室，云南 昆明 650201)

2008年發(fā)布的地理標志產(chǎn)品普洱茶國家標準GB/T 22111─2008中將普洱茶定義為“以地理標志保護范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標志保護范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質(zhì)特征的茶葉”[1]。普洱茶具有降血脂、降血糖、抗衰老、美容減肥以及神經(jīng)保護功能等多種保健功效[2-3]。高壓脈沖電場(high voltage pulsed electric field，HPEF)技術(shù)是一種應用于食品工業(yè)的非熱處理技術(shù)，具有處理時間短、無污染和能耗低等特點，被普遍應用于農(nóng)產(chǎn)品加工、食品殺菌和保鮮以及天然產(chǎn)物的提取等領(lǐng)域[4]。

有學者針對HPEF對普洱茶中細菌、內(nèi)含物及香氣的影響做了一系列的研究，結(jié)果表明，適當?shù)腍PEF條件可以顯著降低普洱茶中的細菌總數(shù)[5]，明顯提高普洱茶茶水浸出物含量[6]，降低總灰分含量[7]，降低咖啡堿含量[8]，提高氨基酸含量[9]，提高香氣主要成分含量[10-11]，促進普洱熟茶中茶多糖的轉(zhuǎn)化[12]，提高普洱熟茶的體外抗氧化活性。自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，會損害機體的組織和細胞，引起慢性疾病及衰老[13]。生物體內(nèi)存在清除自由基的酶系，如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)等。該酶系可通過氧化還原反應將自由基氧化，而抗氧化酶的活力會隨機體年齡增加而減弱[14]。因此，為了進一步探究HPEF處理技術(shù)對普洱茶的作用機理，本文利用HPEF處理后的普洱熟茶，進行動物實驗，通過測定大鼠體內(nèi)不同臟器的抗氧化活性指標，分析了HPEF處理對普洱熟茶體內(nèi)抗氧化功效的影響，從而評估了HPEF處理普洱熟茶對大鼠體內(nèi)抗氧化活性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南臨滄三級普洱熟茶散茶，購自云南福茶茶葉有限公司；茶褐素，購自云南十草木生物科技有限公司(純度≥0.7 g/g)；健康SPF級雌性SD大鼠，購自昆明楚商科技有限公司，體質(zhì)量(245±20)g。南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的GSH-Px、CAT、抑制羥自由基以及MDA測定試劑盒。

DMC-200型高壓脈沖電源及處理箱(大連鼎通科技發(fā)展有限公司)。處理箱為五面密封的有機玻璃處理箱(長71 cm×寬41 cm×高41 cm)。高壓脈沖電源主要參數(shù)如下：輸出電壓：0～69 kV；輸入電壓：AC 220 V±22 V；輸出脈沖占空比：0～70%；輸出脈沖頻率：50 Hz～2000 Hz；輸出功率：2000 W。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPEF參數(shù)的確定 本研究參數(shù)確定參考王白娟等[12]的研究結(jié)果，設(shè)置時間為55 min，頻率為80、99、121、139和162 Hz，電壓在12～22 kV范圍內(nèi)，通過單因素實驗組成55組(表1)。每組茶樣稱取300 g，將經(jīng)HPEF處理的茶樣裝入自封袋中并做好相應的標記。按照國家標準《茶葉感官審評方法》(GB/T 23776─2009)中的審評方法制備待檢茶湯，進行HPEF處理茶樣的感官審評[15]。感官審評結(jié)果為：第45組(HPEF：12 kV/162 Hz/55 min)的感官品質(zhì)最好，收斂性最好。因此，進行動物實驗時選擇12 kV/162 Hz/55 min作為HPEF預處理條件。

表1 HPEF電壓、頻率的設(shè)置

1.2.2 速溶茶粉的制備 本研究采用真空冷凍干燥技術(shù)制備茶粉，分別取未處理的普洱茶和經(jīng)過HPEF處理的普洱茶1 kg，用沸水浸提3次(各次茶水比為1∶20、1∶20、1∶10)，浸提時間分別為10、20、25 min，合并3次浸提液，放入真空冷凍干燥箱中進行干燥，待冰晶完全消失后，將干燥后的茶粉刮下，并放入自封袋中密封保存，茶粉的得率約為25%。

1.2.3 動物實驗的組別設(shè)計 根據(jù)日本東京桑野研究推薦成人每日平均用茶量6 g，我國男女總平均體重60 kg，則成人每日用茶量為每千克體重0.1 g[16-17]。根據(jù)《保健食品功能評價》要求，本實驗按人體推薦量的5倍作為SD大鼠的最低劑量，中、高劑量分別為人體推薦量的10倍和20倍，即高、中、低劑量組分別給予普洱熟茶2.0、1.0、0.5 g/kg。

取大鼠160只，按體重隨機分為8組，每組20只，分別設(shè)置：處理組1：HPEF預處理高劑量組(2.0 g/kg BW)；處理組2：HPEF預處理中劑量組(1.0 g/kg BW)；處理組3：HPEF預處理低劑量組(0.5 g/kg BW)；處理組4：未預處理普洱熟茶高劑量組(2.0 g/kg BW)；處理組5：未預處理普洱熟茶中劑量組(1.0 g/kg BW)；處理組6：未預處理普洱熟茶低劑量組(0.5 g/kg BW)；處理組7：空白對照，飼喂清水；處理組8：陽性(茶褐素)對照組(1.0 g/kg BW)。

小鼠適應1周后，采用灌胃給藥，空白組的大鼠灌胃用相當量的飲用水，灌胃時間為17∶00～19∶00。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)指南》，設(shè)受試樣品給予最短時間為4周;由于實驗條件的限制，設(shè)置8周為受試樣品最長時間。灌胃4周和8周后，分別檢測各組大鼠血清和肝、腎、心、腦中GSH-Px活力、CAT活力、抑制羥自由基能力以及MDA含量。

1.2.4 血清中抗氧化指標的測定 對大鼠股動脈進行采血，先將采集到的血液放入離心管中靜置0.5 h，再進行離心處理。離心機轉(zhuǎn)速為3000 r/min，離心時間為15 min。接著用移液管吸取上層清液，移入預先標好的離心管(容量為5 mL)中，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的GSH-Px、CAT、抑制羥自由基以及MDA測定試劑盒來對其進行指標測定。

1.2.5 組織中抗氧化指標的測定 解剖時觀察組織有無病變，摘取大鼠肝臟組織右葉，摘取大鼠左右腎臟并將血管和外膜去除，摘取大鼠心臟并去除血管與血液，摘取大鼠的腦組織。將各組織分別放入0.9%生理鹽水中漂洗，撈出，放在吸水紙上吸凈水分并稱其總重量，然后放入容量為50 mL的空燒杯中，并將大塊的組織迅速剪碎。向燒杯中準確移取組織重量3倍的0.9%的生理鹽水，置于冷水中進行冷水浴，在冷水浴條件下機械勻漿，得到10%的組織勻漿。設(shè)置離心機的轉(zhuǎn)速為3000 r/min、離心時間為15 min，將組織勻漿放入離心機中進行離心，離心完成后吸取上層清液，按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的GSH-Px、CAT、抑制羥自由基以及MDA測定試劑盒來對其進行指標測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理組對大鼠血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中GSH-Px活力的影響

由圖1可知，相對于空白組，血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中HPEF處理組和普洱茶組均較好地提高了GSH-Px活力，且在心臟組織中HPEF高劑量組灌胃8周后差異性最顯著，GSH-Px活力提高了49.90%達到了極顯著水平(P<0.01)。在相同劑量組條件下，相對于普洱茶組，HPEF處理組較好地提高了血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中GSH-Px活力，且在心臟組織中HPEF低劑量組灌胃8周后差異性最顯著，GSH-Px活力提高了18.13%，達到了極顯著水平(P<0.01)。相對于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清樣本、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中GSH-Px活力均提高了，且在血清中HPEF中劑量組提高作用最明顯，GSH-Px活力增加了0.12%。結(jié)果表明，HPEF處理具有顯著增加GSH-Px活力的作用，其中，高劑量組較空白組影響更顯著(P<0.01)。在同一劑量水平下觀察時間效應，發(fā)現(xiàn)HPEF各劑量組GSH-Px活力隨時間的增加也呈現(xiàn)動態(tài)增加。

“*”和“**”分別表示各處理組與處理組7比較在P<0.05和P<0.01水平上的差異顯著性；“#”和“##”分別表示在同劑量條件下，各處理組在P<0.05和P<0.01水平上的差異性。下同。

2.2 各處理組對大鼠血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中CAT活力的影響

由圖2可知，相對于空白組，血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中HPEF處理組和普洱茶組均較好地提高了CAT活力，且在心臟組織中HPEF高劑量組灌胃8周后差異性最顯著，CAT活力提高了261.13%，達到了極顯著水平(P<0.01)。在相同劑量組條件下，相對于普洱茶組，HPEF處理組均較好地提高了CAT活力，且在肝臟組織中HPEF中劑量組灌胃4周后差異性最顯著，CAT活力提高了26.79%，達到了極顯著水平(P<0.01)。相對于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清樣本、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中CAT活力均提高了，且在血清中HPEF中劑量組提高作用最明顯，CAT活力增加了1.95%。結(jié)果表明，HPEF處理具有顯著增加CAT活力的作用，其中，血清、腎臟、心臟和腦組織中高劑量組較空白組影響更顯著(P<0.01)，而肝臟組織中中劑量組影響更顯著，說明肝臟組織中中劑量組的HPEF處理組能更好地提高CAT活力。

2.3 各處理組對大鼠血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中抑制羥自由基能力的影響

由圖3可知，相對于空白組，血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中HPEF處理組和普洱茶組均較好地提高了抑制羥自由基能力，且在肝臟組織中HPEF高劑量組灌胃8周后差異性最顯著，抑制羥自由基能力提高了90.80%，達到了極顯著水平(P<0.01)。在相同劑量組條件下，相對于普洱茶組，HPEF處理組較好地提高了血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中抑制羥自由基能力，且在心臟組織中HPEF低劑量組灌胃8周后差異性最顯著，抑制羥自由基能力提高了121.20%，達到了極顯著水平(P<0.01)。相對于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清樣本、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中均提高了抑制羥自由基能力，且在肝臟組織中HPEF低劑量組促進作用最明顯，抑制羥自由基能力增加了0.18%。結(jié)果表明，HPEF處理具有顯著增加抑制羥自由基能力的作用，其中肝臟組織和心臟組織中低劑量組較空白組影響更顯著(P<0.01)，腎臟組織和腦組織中高劑量組較空白組影響更顯著(P< 0.01)。

2.4 各處理組對大鼠血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中MDA含量的影響

由圖4可知，相對于空白組，血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中HPEF處理組和普洱茶組均較好地降低了MDA含量，且在腎臟組織中HPEF高劑量組灌胃8周后差異性最顯著，MDA含量降低了27.78%，達到了極顯著水平(P<0.01)。在相同劑量組條件下，相對于普洱茶組HPEF處理組較好地降低了血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中MDA含量，且在心臟組織中HPEF低劑量組灌胃8周后差異性最顯著，MDA含量降低了14.70%，達到了極顯著水平(P<0.01)。相對于灌胃第4周，灌胃第8周后在血清樣本、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中MDA含量均降低了，且在肝臟組織中普洱茶低劑量組降低作用最明顯，MDA含量降低了0.1%。結(jié)果表明，HPEF處理具有顯著降低MDA含量的作用，其中，高劑量組較空白組影響更顯著(P<0.01)。在同一劑量水平下觀察時間效應，發(fā)現(xiàn)HPEF各劑量組MDA含量隨時間的增加也呈現(xiàn)動態(tài)減少。

3 討論與結(jié)論

機體內(nèi)存在著酶和非酶抗氧化防御系統(tǒng)，包括GSH-Px、CAT、抑制羥自由基和MDA等。GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能夠清除自由基，從而降低組織的氧化損傷[18]。CAT是過氧化物酶體的標志酶，是機體內(nèi)有效的過氧化氫清除劑[19]。羥自由基具有極強的得電子能力也就是氧化能力，抑制羥自由基能力是評價抗氧化活性的指標之一。MDA是評判脂質(zhì)過氧化的指標，其含量與細胞損傷程度呈正相關(guān)[20]。

本文采用HPEF處理普洱熟茶，喂食SD大鼠后，對血清、肝、腎、心臟和腦中的GSH-Px活力、CAT活力、抑制羥自由基能力和MDA含量進行檢測，評價HPEF處理后的普洱熟茶抗氧化能力。大鼠灌胃高、中、低劑量組的HPEF處理組和普洱茶組均能夠提高血清中GSH-Px、CAT活力和抑制羥自由基能力，并能有效降低MDA含量，表明普洱熟茶具有抗氧化作用，這與侯艷等[21]的研究結(jié)果一致。在同一劑量條件下普洱熟茶在經(jīng)過HPEF處理后，其各項指標均優(yōu)于普洱茶組，即其抗氧化活性增強；同時抗氧化指標在大鼠血清、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織和腦組織中表現(xiàn)出不同的差異性，即在不同的組織中，抗氧化功能具有差異性。推測是由于血清和各組織中GSH-Px活力、CAT活力、抑制羥自由基能力和MDA含量不同。推測由于高壓脈沖電場可以提高茶多酚的轉(zhuǎn)化率，促進其抗氧化能力的增強[22-23]。

綜上所述，在一定時間內(nèi)，HPEF可以增強機體內(nèi)GSH-Px活力、CAT活力和抑制羥自由基能力，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，從而防御生物體內(nèi)氧化損傷，增強體內(nèi)抗氧化功能。HPEF為普洱茶抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了新思路，對提高普洱熟茶的抗氧化性具有重要的意義，其潛在的應用價值有待進一步深入研究。