張德珍，遲文娟，李婷婷，代惠潔，喬寧，王翠翠

（濰坊科技學院/山東省高校設(shè)施園藝實驗室，山東 壽光 262700）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我國種植面積最大的蔬菜作物之一［1］。隨著我國設(shè)施辣椒栽培量的逐年增加，辣椒疫病已成為嚴重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的一種毀滅性土傳真菌病害。該病害在辣椒整個生育期均可發(fā)生，其病原菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主廣泛，能夠侵染并嚴重危害辣椒、黃瓜、番茄、大豆、南瓜等多種植物［2］，并且可以在土壤中長期存活，造成該病害一旦傳入就難以根治，嚴重時可造成毀棚，導致巨大的經(jīng)濟損失。因此在設(shè)施蔬菜栽培中對辣椒疫病的防控意義重大。

目前生產(chǎn)上普遍采用的化學藥劑防治方法不僅難以根除辣椒疫病，還容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，甚至影響人類健康。相比之下，生物防治以其安全、無毒、環(huán)保等特點，在防治蔬菜病害方面優(yōu)勢凸顯。因此，優(yōu)質(zhì)生防菌種發(fā)掘和高效生防菌劑開發(fā)，對于辣椒疫病的生物防控具有重要意義。在生防細菌中芽孢桿菌（Bacillusspp.）的應(yīng)用最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，部分芽孢桿菌可以通過非核糖體途徑合成脂肽類化合物，包括表面活性素家簇（surfactins）、豐原素家簇（fengycins）和伊枯草菌素家簇（如iturins、bacillomycins和mycosubtilin）［3］，其中豐原素和伊枯草菌素都具有較強的抑制真菌生長的作用［4］。另外，有些芽孢桿菌還可以通過溶磷固氮作用、分泌植物生長激素和促進植物營養(yǎng)功能等方式促進植物生長［5-8］。目前，對具有產(chǎn)脂肽類化合物能力的生防菌的研究主要集中在防治病害方面，而同時研究其促生作用的報道較少。

由于生防菌防病和促生效果的發(fā)揮與土壤環(huán)境條件有關(guān)，因此獲得適宜當?shù)赝寥郎鷳B(tài)環(huán)境的優(yōu)良生防菌株資源，是開發(fā)高適配性生防菌劑、實現(xiàn)設(shè)施蔬菜病害綠色防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。前期從壽光多年進行設(shè)施蔬菜栽培的土壤中篩選獲得了多株對辣椒疫霉菌具有顯著抑制效果的芽孢桿菌菌株，本試驗通過體外試驗和盆栽試驗比較其防病效果和促生能力，檢測了F1-1菌株基因組中脂肽類化合物合成相關(guān)基因，并對其進行分子生物學鑒定，以期為研發(fā)與蔬菜產(chǎn)地環(huán)境適配性更好的生防菌劑和生物農(nóng)藥提供優(yōu)質(zhì)的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生防菌菌株：從山東省壽光市多年栽培蔬菜的設(shè)施土壤中分離并保存。

供試病原菌：辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），由本實驗室分離鑒定后保存。

供試辣椒：香辣一號，由壽光市宏偉種業(yè)有限公司生產(chǎn)。

供試藥劑：50%烯酰嗎啉可濕性粉劑，由德國巴斯夫股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌發(fā)酵液及其脂肽類化合物的制備

挑取活化的生防菌株單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（20 mL）中，于32℃、200 r/min的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，制成種子液。將種子液按照1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，以上述同樣條件振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌培養(yǎng)液調(diào)整發(fā)酵液至菌體含量為1×108cfu/mL，調(diào)整后的發(fā)酵液用于生防菌與辣椒疫霉病菌的對峙試驗和對辣椒防病促生效果的盆栽試驗。

按照上述方法完成接種的培養(yǎng)液在29℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)96 h后，將發(fā)酵液離心除去菌體（6 000 r/min，15 min），用6 mol/L鹽酸將上清液調(diào)至pH=2.0，于4℃冰箱中靜置24 h后，離心收集沉淀（10 000 r/min，10 min），用發(fā)酵液1/10體積的甲醇溶解沉淀，經(jīng)0.22μm的無菌濾膜過濾除菌，獲得脂肽類化合物提取物，氮吹儀吹干后用無菌水溶解，使脂肽類化合物的質(zhì)量濃度為50μg/mL，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 辣椒疫霉孢子液的制備 將活化的辣椒疫霉菌接種于PDA平板上，25℃培養(yǎng)箱黑暗條件下倒置培養(yǎng)5～7 d后，將菌落連同培養(yǎng)基一起切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，加入無菌水，光照條件下培養(yǎng)24 h，于4℃冰箱中靜置30 min，待游動孢子釋放后收集孢子液，調(diào)整游動孢子含量約為1×105cfu/mL，用于生防菌對辣椒疫病防治效果試驗。

1.2.3 生防菌及其脂肽類化合物對辣椒疫霉菌的抑制活性測定 以供試辣椒疫霉菌為靶標菌，分別采用平板對峙法和瓊脂孔擴散法測定生防菌及其脂肽類化合物對辣椒疫霉菌的抑制活性。將經(jīng)活化的辣椒疫霉菌餅接種于PDA平板中央，在菌餅兩側(cè)距離平板邊緣1 cm處接種5μL的生防菌菌懸液（1×108cfu/mL），或在PDA平板相應(yīng)位置打孔并滴加200μL脂肽類化合物提取液，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)5～7 d，測量病原菌的菌落直徑，參照范曉靜等［10］的方法計算抑菌率。每個處理接種3個平板，分別以滴加5μL和200 μL無菌水作為對照，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 生防菌對辣椒疫病的防治作用試驗 將8～10葉期的辣椒苗移栽至裝有滅菌基質(zhì)∶滅菌土壤=1∶1的花盆（Ф=10 cm）中，隨機分為5組，每組12棵（1棵/盆）。3個處理組分別用30 mL的F1-1、F1-3、F1-7發(fā)酵液均勻澆灌各盆辣椒根圍土壤，以30 mL無菌培養(yǎng)液灌根處理作為對照1（CK1），以相同體積的50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 000倍液灌根處理作為對照2（CK2），24 h后于辣椒苗根部接種5 mL辣椒疫霉孢子液。接種后10～15 d調(diào)查發(fā)病情況。試驗設(shè)3次重復(fù)。參照毛愛軍等［11］的辣椒疫病病情分級標準進行統(tǒng)計，計算病情指數(shù)。病情指數(shù)=∑（病級株數(shù)×代表級數(shù)）/（植株總數(shù)×最高代表級值）×100，參照李丹等［12］的方法計算防治效果。

1.2.5 生防菌對辣椒生長的影響試驗 將辣椒苗隨機分為4組，每組12株（1株/盆），處理組每盆分別用30 mL F1-1、F1-3、F1-7的發(fā)酵液（1×108cfu/mL）灌根，對照（CK）組澆灌無菌培養(yǎng)液。處理21 d后，分別測定每株辣椒的株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量和全株干質(zhì)量，并計算壯苗指數(shù)。試驗設(shè)置3次重復(fù)。壯苗指數(shù)=（莖粗/株高）×全株干質(zhì)量。

1.2.6 F1-1脂肽類化合物合成相關(guān)基因的檢測 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取F1-1的基因組DNA，以此為模板，分別用表1中的引物進行PCR擴增。擴增體系：2×Easy Taq?PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）12.5μL，DNA模板（50～100 ng/μL）1μL，引物（100μmol/L）各0.5 μL，加ddH2O補至25μL。擴增程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃50 s，72℃30～120 s，32個循環(huán)；72℃8 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶經(jīng)膠回收后，通過TA克隆的方法分別將DNA片段連接到pEasy-T1（北京全式金生物技術(shù)有限公司）載體上，將篩選獲得的陽性克隆進行測序，所得序列利用DNAMAN 6.0軟件和NCBI數(shù)據(jù)庫的相關(guān)在線軟件進行同源性檢索和序列分析。本試驗中所用引物的合成和DNA片段序列的測定均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

表1 脂肽類化合物合成酶相關(guān)基因擴增的引物序列

1.2.7 F1-1菌株的分子鑒定 以F1-1菌株的基因組DNA為模板，對gyrA序列進行PCR擴增，引物序列［17］為gyrA-F：5′-ATTCACGCTATCACTGACTTATTC-3′和gyrA-R：5′-ATGGGAGACAAAGTAGAACCGAG-3′。擴增體系同1.2.6，擴增程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃120 s，32個循環(huán)；72℃8 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后進行測序，DNA序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫和DNAMAN 6.0軟件的比對分析，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2017和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析；Duncan’s新復(fù)極差法對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌及其脂肽類化合物對辣椒疫霉菌的抑制活性

平板對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果（圖1）表明，供試5株生防菌對辣椒疫霉均表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。F1-1菌株對辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率可達50.95%，顯著高于其余4個菌株。其次為F1-3和F1-7菌株，抑菌率約為40%左右。

圖1 不同生防菌株對辣椒疫霉菌的抑制活性

瓊脂孔擴散試驗表明，5個生防菌株的脂肽類化合物（50μg/mL）均具有抑制辣椒疫霉菌菌絲生長的作用。由圖2可知，從F1-1發(fā)酵液中提取的脂肽類化合物的抑菌效果最好，抑菌率為55.71%，顯著高于其余4個菌株。其次為F1-3菌株，抑菌率為48.71%。表明產(chǎn)生脂肽類化合物可能是這些生防菌對辣椒疫霉病菌表現(xiàn)出抑制活性的一個重要原因。

圖2 不同生防菌株脂肽類化合物提取物 對辣椒疫霉菌的抑制活性

2.2 生防菌對辣椒疫病的防治作用

選擇體外試驗中抑菌效果較好的3個生防菌株F1-1、F1-3和F1-7進行盆栽試驗。由表2可以看出，3個供試菌株對辣椒疫病均具有一定的防治效果。與CK1相比，用生防菌發(fā)酵液灌根處理能顯著降低辣椒疫病的病情指數(shù)，其中F1-1處理組的病情指數(shù)最低，為23.33，雖然略高于CK2組（21.11），但兩者之間差異不顯著。在本試驗條件下，3個菌株的防治效果均可達到50%以上，F(xiàn)1-1組和施用化學藥劑的CK2組的防治效果顯著高于F1-3和F1-7處理組，其中F1-1的防治效果可達到66.91%，其生防效果在3個供試菌株中最好。

表2 不同生防菌對辣椒疫霉的防治效果

2.3 生防菌對辣椒生長的影響

盆栽試驗結(jié)果表明，F(xiàn)1-1、F1-3和F1-7均可促進辣椒生長。由圖3可知，與對照組相比，經(jīng)F1-1和F1-7灌根處理的辣椒株高顯著增加，增幅分別為21.73%和16.01%；經(jīng)F1-1灌根處理的辣椒莖粗比對照組顯著增加15.17%，F(xiàn)1-3和F1-7處理組的莖粗雖然也有所增加（增幅為6.89%和8.51%），但是差異不顯著。

圖3 不同生防菌對辣椒株高和莖粗的影響

由圖4可知，經(jīng)F1-1和F1-3灌根處理的辣椒，全株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比CK組顯著增加，其中，經(jīng)F1-1灌根處理的辣椒全株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量最高，分別為30.17 g和2.89 g，說明F1-1可以促進辣椒植株生長并積累更多的干物質(zhì)。由圖5可知，在供試的3個菌株中，F(xiàn)1-1處理組辣椒的壯苗指數(shù)最高，并顯著高于CK組，增幅為44.00%。表明在本試驗條件下，用F1-1灌根處理對辣椒具有較好的促生效果。

圖4 不同生防菌對辣椒植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

圖5 不同生防菌對辣椒壯苗指數(shù)的影響

2.4 F1-1菌株脂肽類化合物合成相關(guān)基因的檢測

通過PCR從F1-1基因組DNA中擴增得到了7個脂肽類化合物合成相關(guān)基因（圖6），表明F1-1具有合成多種脂肽類化合物的潛力。將獲得的DNA片段克隆測序后進行BLAST同源性分析，結(jié)果表明從F1-1菌株擴增的7個基因序列與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）中相應(yīng)的拮抗物質(zhì)合成功能基因序列的同源性在96%以上，說明利用特異引物擴增到的基因片段為相應(yīng)的拮抗物質(zhì)合成相關(guān)基因序列。

圖6 F1-1菌株脂肽類化合物合成相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.5 F1-1菌株的分子鑒定

以F1-1菌株的基因組DNA為模板，采用gyrA基因特異性引物進行PCR擴增，經(jīng)測序分析，得到一段長度為2 424 bp的DNA序列。由系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖7）可知，F(xiàn)1-1菌株與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensisBY6（NZ_CP051011）親緣關(guān)系最近，同源性達到100%，因此將F1-1菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖7 F1-1菌株基于gyrA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

辣椒疫病是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)上的一種危害嚴重又難于根治的土傳真菌病害，針對該病害的防控是目前設(shè)施蔬菜栽培中生物防治領(lǐng)域的研究熱點。汪濤等［18］采用噴淋的方法對辣椒莖基部施用多粘類芽孢桿菌TC35的發(fā)酵液，防治效果達80%以上；郝楠等［19］對側(cè)孢短芽孢桿菌A60菌株進行室內(nèi)防效測定，該生防菌對辣椒疫病的防治效果可達70%。本試驗結(jié)果表明，在室內(nèi)盆栽條件下，F(xiàn)1-1菌發(fā)酵液能有效降低辣椒苗感染疫病的病情指數(shù)，防治效果可達66.91%，高于楊定祥等［20］報道的解淀粉芽孢桿菌SH-27菌株的發(fā)酵液對辣椒疫病的防治效果（48.20%）。

目前已報道的對辣椒疫病有較好防治效果的生防細菌主要集中在芽孢桿菌屬，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［21］、解 淀 粉 芽 孢 桿 菌（B.amyloliquefaciens）［20，22］、短小芽孢桿菌（B.pumilus）［23］、多 粘 類 芽 孢 桿 菌（Paenibacillus polymyxa）［18，24］和 側(cè) 孢 短 芽 孢 桿 菌（B.laterosporus）［21］等。本試驗對生防效果較好的F1-1菌株進行了基于gyrA基因的特異性序列分析及同源性比對，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株F1-1為貝萊斯芽孢桿菌。Ruiz-García等［25］研究報道，貝萊斯芽孢桿菌能夠分泌產(chǎn)生表面活性劑等生物活性物質(zhì)，具有抗細菌、真菌等功能。羅楚平等［3］報道枯草芽孢桿菌916產(chǎn)生的bacillomycin L能使病原真菌菌絲發(fā)生畸形和抑制真菌孢子萌發(fā)。F1-1的脂肽類化合物提取物對辣椒疫霉菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，在F1-1的基因組中檢測到了surfactins、fengycins、iturins三大家簇的多種脂肽類化合物相關(guān)合成基因的存在，表明產(chǎn)生脂肽類化合物是F1-1對辣椒疫霉菌發(fā)揮抑制效果的重要因素。生防菌對土傳病害的防控機制存在多樣性、協(xié)同性、綜合性，其作用機理可能涉及定殖、抑菌、抗性誘導等多個方面［26，27］。本試驗發(fā)現(xiàn)不同芽孢桿菌菌株之間的抑菌能力和生防效果存在差異，其相關(guān)機理還有待進一步研究。

已有的研究結(jié)果表明，一些芽孢桿菌可以作為植物根際促生菌促進作物的生長發(fā)育。婁義等［28］證明芽孢桿菌Bs10、Ba12和Bl10能明顯促進番茄的胚軸、胚根和植株的生長；楊定祥等［20］證明，用來自海洋的解淀粉芽孢桿菌SH-27發(fā)酵液處理辣椒，能顯著增加植株的根長、株高、莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。在本試驗中，F(xiàn)1-1的發(fā)酵液可顯著增加辣椒苗的株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量和壯苗指數(shù)，這對于調(diào)節(jié)苗期辣椒適應(yīng)設(shè)施栽培條件、增強對病害的抵抗能力具有一定的意義。

綜上所述，F(xiàn)1-1可以作為優(yōu)良的生防菌株資源，用以開發(fā)兼具防治病害和壯苗促生功效的生防菌劑，實現(xiàn)替代或部分替代化學藥劑進行辣椒疫病等設(shè)施蔬菜土傳病害的防治，以達到減量用藥的目的，推動設(shè)施蔬菜病害綠色防控的發(fā)展。