張德珍，遲文娟，李婷婷，代惠潔，喬寧，王翠翠

（濰坊科技學(xué)院/山東省高校設(shè)施園藝實(shí)驗(yàn)室，山東 壽光 262700）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物之一［1］。隨著我國(guó)設(shè)施辣椒栽培量的逐年增加，辣椒疫病已成為嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的一種毀滅性土傳真菌病害。該病害在辣椒整個(gè)生育期均可發(fā)生，其病原菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主廣泛，能夠侵染并嚴(yán)重危害辣椒、黃瓜、番茄、大豆、南瓜等多種植物［2］，并且可以在土壤中長(zhǎng)期存活，造成該病害一旦傳入就難以根治，嚴(yán)重時(shí)可造成毀棚，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此在設(shè)施蔬菜栽培中對(duì)辣椒疫病的防控意義重大。

目前生產(chǎn)上普遍采用的化學(xué)藥劑防治方法不僅難以根除辣椒疫病，還容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，甚至影響人類(lèi)健康。相比之下，生物防治以其安全、無(wú)毒、環(huán)保等特點(diǎn)，在防治蔬菜病害方面優(yōu)勢(shì)凸顯。因此，優(yōu)質(zhì)生防菌種發(fā)掘和高效生防菌劑開(kāi)發(fā)，對(duì)于辣椒疫病的生物防控具有重要意義。在生防細(xì)菌中芽孢桿菌（Bacillusspp.）的應(yīng)用最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，部分芽孢桿菌可以通過(guò)非核糖體途徑合成脂肽類(lèi)化合物，包括表面活性素家簇（surfactins）、豐原素家簇（fengycins）和伊枯草菌素家簇（如iturins、bacillomycins和mycosubtilin）［3］，其中豐原素和伊枯草菌素都具有較強(qiáng)的抑制真菌生長(zhǎng)的作用［4］。另外，有些芽孢桿菌還可以通過(guò)溶磷固氮作用、分泌植物生長(zhǎng)激素和促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)功能等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)［5-8］。目前，對(duì)具有產(chǎn)脂肽類(lèi)化合物能力的生防菌的研究主要集中在防治病害方面，而同時(shí)研究其促生作用的報(bào)道較少。

由于生防菌防病和促生效果的發(fā)揮與土壤環(huán)境條件有關(guān)，因此獲得適宜當(dāng)?shù)赝寥郎鷳B(tài)環(huán)境的優(yōu)良生防菌株資源，是開(kāi)發(fā)高適配性生防菌劑、實(shí)現(xiàn)設(shè)施蔬菜病害綠色防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。前期從壽光多年進(jìn)行設(shè)施蔬菜栽培的土壤中篩選獲得了多株對(duì)辣椒疫霉菌具有顯著抑制效果的芽孢桿菌菌株，本試驗(yàn)通過(guò)體外試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)比較其防病效果和促生能力，檢測(cè)了F1-1菌株基因組中脂肽類(lèi)化合物合成相關(guān)基因，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期為研發(fā)與蔬菜產(chǎn)地環(huán)境適配性更好的生防菌劑和生物農(nóng)藥提供優(yōu)質(zhì)的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生防菌菌株：從山東省壽光市多年栽培蔬菜的設(shè)施土壤中分離并保存。

供試病原菌：辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici），由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定后保存。

供試?yán)苯罚合憷币惶?hào)，由壽光市宏偉種業(yè)有限公司生產(chǎn)。

供試藥劑：50%烯酰嗎啉可濕性粉劑，由德國(guó)巴斯夫股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌發(fā)酵液及其脂肽類(lèi)化合物的制備

挑取活化的生防菌株單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（20 mL）中，于32℃、200 r/min的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，制成種子液。將種子液按照1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，以上述同樣條件振蕩培養(yǎng)48 h，用無(wú)菌培養(yǎng)液調(diào)整發(fā)酵液至菌體含量為1×108cfu/mL，調(diào)整后的發(fā)酵液用于生防菌與辣椒疫霉病菌的對(duì)峙試驗(yàn)和對(duì)辣椒防病促生效果的盆栽試驗(yàn)。

按照上述方法完成接種的培養(yǎng)液在29℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)96 h后，將發(fā)酵液離心除去菌體（6 000 r/min，15 min），用6 mol/L鹽酸將上清液調(diào)至pH=2.0，于4℃冰箱中靜置24 h后，離心收集沉淀（10 000 r/min，10 min），用發(fā)酵液1/10體積的甲醇溶解沉淀，經(jīng)0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，獲得脂肽類(lèi)化合物提取物，氮吹儀吹干后用無(wú)菌水溶解，使脂肽類(lèi)化合物的質(zhì)量濃度為50μg/mL，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 辣椒疫霉孢子液的制備 將活化的辣椒疫霉菌接種于PDA平板上，25℃培養(yǎng)箱黑暗條件下倒置培養(yǎng)5～7 d后，將菌落連同培養(yǎng)基一起切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，加入無(wú)菌水，光照條件下培養(yǎng)24 h，于4℃冰箱中靜置30 min，待游動(dòng)孢子釋放后收集孢子液，調(diào)整游動(dòng)孢子含量約為1×105cfu/mL，用于生防菌對(duì)辣椒疫病防治效果試驗(yàn)。

1.2.3 生防菌及其脂肽類(lèi)化合物對(duì)辣椒疫霉菌的抑制活性測(cè)定 以供試?yán)苯芬呙咕鸀榘袠?biāo)菌，分別采用平板對(duì)峙法和瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定生防菌及其脂肽類(lèi)化合物對(duì)辣椒疫霉菌的抑制活性。將經(jīng)活化的辣椒疫霉菌餅接種于PDA平板中央，在菌餅兩側(cè)距離平板邊緣1 cm處接種5μL的生防菌菌懸液（1×108cfu/mL），或在PDA平板相應(yīng)位置打孔并滴加200μL脂肽類(lèi)化合物提取液，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)5～7 d，測(cè)量病原菌的菌落直徑，參照范曉靜等［10］的方法計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理接種3個(gè)平板，分別以滴加5μL和200 μL無(wú)菌水作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 生防菌對(duì)辣椒疫病的防治作用試驗(yàn) 將8～10葉期的辣椒苗移栽至裝有滅菌基質(zhì)∶滅菌土壤=1∶1的花盆（Ф=10 cm）中，隨機(jī)分為5組，每組12棵（1棵/盆）。3個(gè)處理組分別用30 mL的F1-1、F1-3、F1-7發(fā)酵液均勻澆灌各盆辣椒根圍土壤，以30 mL無(wú)菌培養(yǎng)液灌根處理作為對(duì)照1（CK1），以相同體積的50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 000倍液灌根處理作為對(duì)照2（CK2），24 h后于辣椒苗根部接種5 mL辣椒疫霉孢子液。接種后10～15 d調(diào)查發(fā)病情況。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。參照毛愛(ài)軍等［11］的辣椒疫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)=∑（病級(jí)株數(shù)×代表級(jí)數(shù)）/（植株總數(shù)×最高代表級(jí)值）×100，參照李丹等［12］的方法計(jì)算防治效果。

1.2.5 生防菌對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響試驗(yàn) 將辣椒苗隨機(jī)分為4組，每組12株（1株/盆），處理組每盆分別用30 mL F1-1、F1-3、F1-7的發(fā)酵液（1×108cfu/mL）灌根，對(duì)照（CK）組澆灌無(wú)菌培養(yǎng)液。處理21 d后，分別測(cè)定每株辣椒的株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量和全株干質(zhì)量，并計(jì)算壯苗指數(shù)。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。壯苗指數(shù)=（莖粗/株高）×全株干質(zhì)量。

1.2.6 F1-1脂肽類(lèi)化合物合成相關(guān)基因的檢測(cè) 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取F1-1的基因組DNA，以此為模板，分別用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2×Easy Taq?PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）12.5μL，DNA模板（50～100 ng/μL）1μL，引物（100μmol/L）各0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)至25μL。擴(kuò)增程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃50 s，72℃30～120 s，32個(gè)循環(huán)；72℃8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶經(jīng)膠回收后，通過(guò)TA克隆的方法分別將DNA片段連接到pEasy-T1（北京全式金生物技術(shù)有限公司）載體上，將篩選獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，所得序列利用DNAMAN 6.0軟件和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)在線軟件進(jìn)行同源性檢索和序列分析。本試驗(yàn)中所用引物的合成和DNA片段序列的測(cè)定均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

表1 脂肽類(lèi)化合物合成酶相關(guān)基因擴(kuò)增的引物序列

1.2.7 F1-1菌株的分子鑒定 以F1-1菌株的基因組DNA為模板，對(duì)gyrA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列［17］為gyrA-F：5′-ATTCACGCTATCACTGACTTATTC-3′和gyrA-R：5′-ATGGGAGACAAAGTAGAACCGAG-3′。擴(kuò)增體系同1.2.6，擴(kuò)增程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃120 s，32個(gè)循環(huán)；72℃8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后進(jìn)行測(cè)序，DNA序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和DNAMAN 6.0軟件的比對(duì)分析，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2017和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析；Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌及其脂肽類(lèi)化合物對(duì)辣椒疫霉菌的抑制活性

平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，供試5株生防菌對(duì)辣椒疫霉均表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。F1-1菌株對(duì)辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率可達(dá)50.95%，顯著高于其余4個(gè)菌株。其次為F1-3和F1-7菌株，抑菌率約為40%左右。

圖1 不同生防菌株對(duì)辣椒疫霉菌的抑制活性

瓊脂孔擴(kuò)散試驗(yàn)表明，5個(gè)生防菌株的脂肽類(lèi)化合物（50μg/mL）均具有抑制辣椒疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的作用。由圖2可知，從F1-1發(fā)酵液中提取的脂肽類(lèi)化合物的抑菌效果最好，抑菌率為55.71%，顯著高于其余4個(gè)菌株。其次為F1-3菌株，抑菌率為48.71%。表明產(chǎn)生脂肽類(lèi)化合物可能是這些生防菌對(duì)辣椒疫霉病菌表現(xiàn)出抑制活性的一個(gè)重要原因。

圖2 不同生防菌株脂肽類(lèi)化合物提取物 對(duì)辣椒疫霉菌的抑制活性

2.2 生防菌對(duì)辣椒疫病的防治作用

選擇體外試驗(yàn)中抑菌效果較好的3個(gè)生防菌株F1-1、F1-3和F1-7進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。由表2可以看出，3個(gè)供試菌株對(duì)辣椒疫病均具有一定的防治效果。與CK1相比，用生防菌發(fā)酵液灌根處理能顯著降低辣椒疫病的病情指數(shù)，其中F1-1處理組的病情指數(shù)最低，為23.33，雖然略高于CK2組（21.11），但兩者之間差異不顯著。在本試驗(yàn)條件下，3個(gè)菌株的防治效果均可達(dá)到50%以上，F(xiàn)1-1組和施用化學(xué)藥劑的CK2組的防治效果顯著高于F1-3和F1-7處理組，其中F1-1的防治效果可達(dá)到66.91%，其生防效果在3個(gè)供試菌株中最好。

表2 不同生防菌對(duì)辣椒疫霉的防治效果

2.3 生防菌對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)1-1、F1-3和F1-7均可促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)。由圖3可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)F1-1和F1-7灌根處理的辣椒株高顯著增加，增幅分別為21.73%和16.01%；經(jīng)F1-1灌根處理的辣椒莖粗比對(duì)照組顯著增加15.17%，F(xiàn)1-3和F1-7處理組的莖粗雖然也有所增加（增幅為6.89%和8.51%），但是差異不顯著。

圖3 不同生防菌對(duì)辣椒株高和莖粗的影響

由圖4可知，經(jīng)F1-1和F1-3灌根處理的辣椒，全株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比CK組顯著增加，其中，經(jīng)F1-1灌根處理的辣椒全株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量最高，分別為30.17 g和2.89 g，說(shuō)明F1-1可以促進(jìn)辣椒植株生長(zhǎng)并積累更多的干物質(zhì)。由圖5可知，在供試的3個(gè)菌株中，F(xiàn)1-1處理組辣椒的壯苗指數(shù)最高，并顯著高于CK組，增幅為44.00%。表明在本試驗(yàn)條件下，用F1-1灌根處理對(duì)辣椒具有較好的促生效果。

圖4 不同生防菌對(duì)辣椒植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

圖5 不同生防菌對(duì)辣椒壯苗指數(shù)的影響

2.4 F1-1菌株脂肽類(lèi)化合物合成相關(guān)基因的檢測(cè)

通過(guò)PCR從F1-1基因組DNA中擴(kuò)增得到了7個(gè)脂肽類(lèi)化合物合成相關(guān)基因（圖6），表明F1-1具有合成多種脂肽類(lèi)化合物的潛力。將獲得的DNA片段克隆測(cè)序后進(jìn)行BLAST同源性分析，結(jié)果表明從F1-1菌株擴(kuò)增的7個(gè)基因序列與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）中相應(yīng)的拮抗物質(zhì)合成功能基因序列的同源性在96%以上，說(shuō)明利用特異引物擴(kuò)增到的基因片段為相應(yīng)的拮抗物質(zhì)合成相關(guān)基因序列。

圖6 F1-1菌株脂肽類(lèi)化合物合成相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.5 F1-1菌株的分子鑒定

以F1-1菌株的基因組DNA為模板，采用gyrA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序分析，得到一段長(zhǎng)度為2 424 bp的DNA序列。由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖7）可知，F(xiàn)1-1菌株與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensisBY6（NZ_CP051011）親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到100%，因此將F1-1菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖7 F1-1菌株基于gyrA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

辣椒疫病是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)上的一種危害嚴(yán)重又難于根治的土傳真菌病害，針對(duì)該病害的防控是目前設(shè)施蔬菜栽培中生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。汪濤等［18］采用噴淋的方法對(duì)辣椒莖基部施用多粘類(lèi)芽孢桿菌TC35的發(fā)酵液，防治效果達(dá)80%以上；郝楠等［19］對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌A60菌株進(jìn)行室內(nèi)防效測(cè)定，該生防菌對(duì)辣椒疫病的防治效果可達(dá)70%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在室內(nèi)盆栽條件下，F(xiàn)1-1菌發(fā)酵液能有效降低辣椒苗感染疫病的病情指數(shù)，防治效果可達(dá)66.91%，高于楊定祥等［20］報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌SH-27菌株的發(fā)酵液對(duì)辣椒疫病的防治效果（48.20%）。

目前已報(bào)道的對(duì)辣椒疫病有較好防治效果的生防細(xì)菌主要集中在芽孢桿菌屬，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［21］、解 淀 粉 芽 孢 桿 菌（B.amyloliquefaciens）［20，22］、短小芽孢桿菌（B.pumilus）［23］、多 粘 類(lèi) 芽 孢 桿 菌（Paenibacillus polymyxa）［18，24］和 側(cè) 孢 短 芽 孢 桿 菌（B.laterosporus）［21］等。本試驗(yàn)對(duì)生防效果較好的F1-1菌株進(jìn)行了基于gyrA基因的特異性序列分析及同源性比對(duì)，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株F1-1為貝萊斯芽孢桿菌。Ruiz-García等［25］研究報(bào)道，貝萊斯芽孢桿菌能夠分泌產(chǎn)生表面活性劑等生物活性物質(zhì)，具有抗細(xì)菌、真菌等功能。羅楚平等［3］報(bào)道枯草芽孢桿菌916產(chǎn)生的bacillomycin L能使病原真菌菌絲發(fā)生畸形和抑制真菌孢子萌發(fā)。F1-1的脂肽類(lèi)化合物提取物對(duì)辣椒疫霉菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，在F1-1的基因組中檢測(cè)到了surfactins、fengycins、iturins三大家簇的多種脂肽類(lèi)化合物相關(guān)合成基因的存在，表明產(chǎn)生脂肽類(lèi)化合物是F1-1對(duì)辣椒疫霉菌發(fā)揮抑制效果的重要因素。生防菌對(duì)土傳病害的防控機(jī)制存在多樣性、協(xié)同性、綜合性，其作用機(jī)理可能涉及定殖、抑菌、抗性誘導(dǎo)等多個(gè)方面［26，27］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同芽孢桿菌菌株之間的抑菌能力和生防效果存在差異，其相關(guān)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

已有的研究結(jié)果表明，一些芽孢桿菌可以作為植物根際促生菌促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育。婁義等［28］證明芽孢桿菌Bs10、Ba12和Bl10能明顯促進(jìn)番茄的胚軸、胚根和植株的生長(zhǎng)；楊定祥等［20］證明，用來(lái)自海洋的解淀粉芽孢桿菌SH-27發(fā)酵液處理辣椒，能顯著增加植株的根長(zhǎng)、株高、莖粗、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)1-1的發(fā)酵液可顯著增加辣椒苗的株高、莖粗、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量和壯苗指數(shù)，這對(duì)于調(diào)節(jié)苗期辣椒適應(yīng)設(shè)施栽培條件、增強(qiáng)對(duì)病害的抵抗能力具有一定的意義。

綜上所述，F(xiàn)1-1可以作為優(yōu)良的生防菌株資源，用以開(kāi)發(fā)兼具防治病害和壯苗促生功效的生防菌劑，實(shí)現(xiàn)替代或部分替代化學(xué)藥劑進(jìn)行辣椒疫病等設(shè)施蔬菜土傳病害的防治，以達(dá)到減量用藥的目的，推動(dòng)設(shè)施蔬菜病害綠色防控的發(fā)展。