朱偉峰 陳 露 譚 凱 王高杰 蔡承志

1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；3.國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070

巴氏桿菌病（pasteurellosis）主要由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）引起，是多種畜禽、野生動(dòng)物和人類的一種傳染病的總稱。巴氏桿菌病呈地方流行性，會造成動(dòng)物死亡或影響其生長、降低飼料報(bào)酬，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。巴氏桿菌病因發(fā)病程度和感染動(dòng)物不同而有不同的病名，如豬肺疫、豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎、禽霍亂、牛出血性敗血癥、兔巴氏桿菌病（兔出血性敗血癥）等，其中多數(shù)疫病被中國政府列為二類動(dòng)物疫病[3]。近年來，巴氏桿菌在多種動(dòng)物中的臨床分離或檢出率都位居前列[4-7]。多殺性巴氏桿菌同樣可以造成人類感染發(fā)病，是一種人獸共患病病原體[1-2]。

根據(jù)莢膜多糖抗原性的差異可以將巴氏桿菌分為A、B、D、E、F等5個(gè)血清型，除E型外其他4個(gè)血清型均為臨床常見血清型[8]。目前對巴氏桿菌的免疫保護(hù)機(jī)制和致病機(jī)制依然不完全清楚[2-9]，我們前期主要針對巴氏桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）致病作用和免疫保護(hù)作用開展了研究，研究結(jié)果顯示巴氏桿菌的GAPDH 分子具有黏附宿主細(xì)胞和分子的作用[10]，同時(shí)作為抗原巴氏桿菌GAPDH 還具有免疫保護(hù)效應(yīng)[11]。抗原表位是抗原引發(fā)免疫保護(hù)的物質(zhì)基礎(chǔ)[12-13]，部分抗原表位既是抗體發(fā)揮作用的位點(diǎn)，也是病原菌對宿主發(fā)揮作用的關(guān)鍵位點(diǎn)（即致病性表位）[14]。因而通過鑒定巴氏桿菌GAPDH 的B 細(xì)胞表位有助于進(jìn)一步理解GAPDH 免疫保護(hù)效應(yīng)的本質(zhì)，并為進(jìn)一步研究GAPDH 的致病作用提供條件。伴隨生物信息學(xué)的發(fā)展，不斷有學(xué)者試圖開發(fā)能夠預(yù)測抗原表位的軟件，近年來在線軟件Bepipred-2.0 對于線性B 細(xì)胞表位已經(jīng)有了比較好的預(yù)測效果[15]。本研究的目的是預(yù)測巴氏桿菌GAPDH 分子的線性B 細(xì)胞表位并進(jìn)一步鑒定預(yù)測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 基因序列來源

本研究用于序列分析巴氏桿菌GAPDH 氨基酸序列均來自已經(jīng)完成基因組測序的巴氏桿菌的基因組數(shù)據(jù)：C51-17（A 型，NZ_MAPQ01000003.1）、PMTB2.1（B 型，NZ_CP007205）、HN06（D 型，NC_017027）、Pm70（F 型，NC_002663）。所有序列從自美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫NCBI-GenBank公共數(shù)據(jù)庫中獲得。

1.2 生物材料及主要試劑

鼠源巴氏桿菌GAPDH 高免血清在以前的試驗(yàn)[10]中已經(jīng)制備并保存。ELISA 板購自美國Costar公司，HRP 鼠二抗購自Biosharp 公司，TMB 單組分顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 不同菌株GAPDH一級結(jié)構(gòu)的比較

使用在線軟件Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）完成氨基酸序列多序列比對，比較1.1中不同巴氏桿菌GAPDH氨基酸序之間的相似性。

1.4 巴氏桿菌GAPDH表位預(yù)測

使用在線軟件Bepipred-2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope-prediction-vr.html）分析巴氏桿菌GAPDH 分子上各個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成表位的能力。以軟件默認(rèn)的0.5 為閾值，高于此閾值且有較長連續(xù)序列的一段多肽被預(yù)測為GAPDH 分子的線性B細(xì)胞表位。

1.5 表位多肽的化學(xué)合成

針對Bepipred-2.0 所預(yù)測到的線性B 細(xì)胞表位，通過南京金斯瑞生物科技股份有限公司化學(xué)合成對應(yīng)序列的線性多肽。合成過程簡述如下，使用固相肽合成法（SPPS）合成多肽，即依次向樹脂中添加氨基酸以構(gòu)建肽鏈。當(dāng)合成完成后，首先去保護(hù)N-端的Fmoc 基團(tuán)，然后去保護(hù)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，最后將多肽從樹脂上切割下來。粗肽液樣品溶解后，注入高效液相色譜（HPLC）儀，對色譜中出現(xiàn)的每個(gè)部分進(jìn)行分子量和純度測試，以確認(rèn)目標(biāo)多肽含量。如果預(yù)測到的抗原表位長度均超過25 個(gè)氨基酸殘基，常規(guī)合成難度較大，則合成能夠覆蓋對應(yīng)表位的重疊多肽以完成后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 表位與GAPDH高免血清的反應(yīng)

使用間接ELISA法[16]鑒定多肽與血清的反應(yīng)性，簡要敘述如下。以多肽包被ELISA 板（10 μg/孔，對照組不包被任何抗原），37 ℃孵育2 h。以PBST洗滌5 次后，使用5%脫脂乳于37 ℃下封閉1 h。接下來孵育1/200 稀釋的巴氏桿菌C51-17 株GAPDH 高免血清，37 ℃下1 h。以PBST 洗滌5 遍后，孵育偶聯(lián)HRP的羊抗鼠二抗，37 ℃下孵育30 min。經(jīng)過5遍洗滌后加入100 μL的TMB單組分顯色液，反應(yīng)10 min后加入50 μL 終止液（2 mol/L 硫酸）。最后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用平均值（means）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）來表示，用t檢驗(yàn)檢測試驗(yàn)組和對照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株GAPDH氨基酸序列的相似性

通過多序列比較發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌不同血清型菌株C51-17、PMTB2.1、HN06、Pm70的GAPDH氨基酸序列高度保守，僅HN06 發(fā)生了A288T 一處點(diǎn)突變（未展示多序列比對結(jié)果）。

2.2 GAPDH線性B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

選擇巴氏桿菌C51-17 株的GAPDH 序列進(jìn)行預(yù)測分析，所預(yù)測的巴氏桿菌GAPDH 線性B 細(xì)胞表位的分布狀況如圖1所示。有多段連續(xù)序列高于軟件默認(rèn)的閾值0.5，本研究選擇了最長的3個(gè)片段（分別記為PMepitope1、PMepitope2、PMepitope3，表1、圖2）作為預(yù)測到的線性B 細(xì)胞表位進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 巴氏桿菌GAPDH各氨基酸殘基構(gòu)成表位能力及線性B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

圖2 所預(yù)測到的表位在巴氏桿菌GAPDH分子上的位置

2.3 表位對應(yīng)多肽與GAPDH高免血清的反應(yīng)

以人工化學(xué)合成方式制備所預(yù)測表位PMepitope1、PMepitope2、PMepitope3 對應(yīng)的多肽（分別標(biāo)記為PMG-1、PMG-2（A-D）、PMG-3）（表1）。由于PMG-2C 結(jié)構(gòu)特殊，經(jīng)過反復(fù)和嘗試都沒有成功合成，所以本次試驗(yàn)沒有使用該條多肽。

表1 巴氏桿菌和GAPDH線性B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果及對應(yīng)多肽合成情況

巴氏桿菌GAPDH 的抗原表位PMepitope2 對應(yīng)的合成多肽PMG-2（A、B、D）均能夠與巴氏桿菌GAPDH 高免血清發(fā)生明顯的反應(yīng)（P＜0.05），但是PMepitope1和PMepitope3對應(yīng)的合成多肽（PMG-1、PMG-3）則不能與巴氏桿菌GAPDH 高免血清發(fā)生反應(yīng)（P＞0.05）。該結(jié)果證實(shí)所預(yù)測到的PMepitope2是巴氏桿菌GAPDH 的抗原表位，但PMepitope1 和PMepitope3則不是巴氏桿菌GAPDH的抗原表位。

3 討 論

BepiPred-2.0 是通過隨機(jī)森林算法學(xué)習(xí)來自于抗體-抗原復(fù)合物結(jié)構(gòu)的表位數(shù)據(jù)進(jìn)而建立起的一種表位預(yù)測工具，它對于線性B 細(xì)胞表位的預(yù)測能力尤為突出[15]。所以本研究選擇了該軟件預(yù)測巴氏桿菌GAPDH 的表位。依照軟件使用方法，預(yù)測分值高于0.5 且長度較長的多肽構(gòu)成表位的可能性較大，所以本研究選擇了長度最長的3 段片段來作為預(yù)測到的表位進(jìn)行研究。通過合成多肽與GAPDH高免血清的反應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)了其中1個(gè)是表位。研究結(jié)果證實(shí)BepiPred-2.0 具有較好的表位預(yù)測能力，特別是當(dāng)所預(yù)測表位較長時(shí)效果良好。

通過ELISA 驗(yàn)證，本研究最終確認(rèn)PMepitope2分別是巴氏桿菌GAPDH和巴氏桿菌GAPDH的線性B 細(xì)胞表位。該表位的序列及其在GAPDH 分子上的位置與之前研究所鑒定到的GAPDH表位[17-18]都不同，是新的表位。之前的文獻(xiàn)報(bào)道顯示GAPDH表位在抗原提呈、調(diào)理吞噬等方面發(fā)揮作用，本研究所鑒定到的表位可能也具有類似的免疫學(xué)效應(yīng)，以后應(yīng)進(jìn)一步研究，并在疫苗設(shè)計(jì)中加以利用。

圖3 間接ELISA法檢測多肽與高免血清之間反應(yīng)的結(jié)果

我們的研究結(jié)果顯示GAPDH具有高度保守的特點(diǎn)。巴氏桿菌不同血清型菌株的GAPDH一級結(jié)構(gòu)高度相似，僅有1個(gè)點(diǎn)突變，本研究所鑒定到的表位所在位點(diǎn)序列完全相同。最近已經(jīng)有研究顯示細(xì)菌保守蛋白的表位可以用于建立特異性的診斷方法[16]，因而將來還可以以本研究所鑒定到的表位（PMepitope2）為基礎(chǔ)建立巴氏桿菌感染的特異性診斷方法。我們的前期工作表明，GAPDH是巴氏桿菌的黏附因子，某些氨基酸位點(diǎn)可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。其他學(xué)者的研究則表明有的抗原表位同時(shí)也是病原和宿主相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)[20-22]，因而本研究所鑒定到的表位可為研究巴氏桿菌與宿主相互作用提供新的線索。

本研究成功預(yù)測并鑒定到1個(gè)巴氏桿菌的抗原表位，該表位將為以后的巴氏桿菌GAPDH免疫保護(hù)機(jī)制、致病機(jī)制研究提供新的線索，并為基于GAPDH抗原表位的疫苗設(shè)計(jì)和診斷試劑開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。