劉廷利 郭冬姝 姚瑤 張保龍

摘要：? 利用RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術可以進行基因功能研究以及作物遺傳改良，但常規(guī)構建RNAi載體方法費時費力。本研究報道了一種基于 USER 酶一步法快速構建RNAi發(fā)夾結構的載體2301/RNAi/OS及其應用方法，操作簡便，省時省力。與已報道的利用酶切連接、Gateway兼容的同源重組或PCR直接連接等構建RNAi載體相比，該載體不需要酶切片段，片段擴增完成后即可與制備好的線性化載體進行反應，縮短操作流程和時間，提高成功率;該載體對插入片段的酶切位點和長度沒有要求，理論上任何位置和長度的片段均可進入2301/RNAi/OS載體中，尤其是長片段RNAi的構建。本試驗以本氏煙（ Nicotiana ??benthamiana ） PDS ?（ Phytoene desaturase ） 基因為例，利用農桿菌介導的瞬時表達體系驗證了該RNAi能夠在植物體內有效地實現(xiàn)基因沉默。該載體以新霉素磷酸轉移酶基因（ NPTII ）作為篩選標記基因，可以利用卡那霉素（Kanamycin）和G418（Geneticin）等抗生素篩選轉基因陽性植株，適合單子葉和雙子葉植物的遺傳轉化。

關鍵詞：? RNA干擾（RNAi）; ?USER 酶; 一步法; 載體構建; 基因沉默

中圖分類號：? Q782??? 文獻標識碼： A??? 文章編號：? 1000-4440（2021）05-1131-06

A one-step method for rapid construction of long-fragment RNA interference vector

LIU Ting-li， GUO Dong-shu， YAO Yao， ZHANG Bao-long

（Excellence and Innovation Center， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：? RNA interference （RNAi） technology can be used for gene function research and crop genetic improvement， but the conventional construction method of RNAi vector is time-consuming and laborious. In this research， we provide a one-step method for rapid construction of long-fragment RNAi vector using uracil-specific excision reagent （ USER ） enzyme. The method is simple， time-saving and labor-saving. Compared with the reported RNAi vectors constructed by restriction enzyme ligation method， Gateway compatible homologous recombination method and PCR direct ligation method， this vector dose not need enzyme digestion fragments. After the fragment amplification is completed， it can react with the prepared lineurized vector. Therefore， the operation process and time are shortened， and the success rate is improved. This vector has no requirements for the restriction site and length of the inserted fragment. Using ?neomycin phosphotransferase ?（ NPTII ） as selective marker gene in this vector， kanamycin and geneticin （G418） can be used to screen transgenic positive plants. It is suitable for genetic transformation of dicot and monocot plants.

Key words：? RNA interference（RNAi）; ?USER ?enzyme; one-step method; vector construction; gene silencing

Fire等發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA （dsRNA）可引發(fā)線蟲體內的基因沉默，并將這一現(xiàn)象命名為RNA干擾（RNAi）。真核生物體內形成的雙鏈RNA或部分雙鏈RNA發(fā)夾結構可被雙鏈RNA專一的核酸內切酶 Dicer 或 Dicer-like ?（ DCL ） 剪切，產生的siRNA （Small interference RNA）形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex， RISC），通過RNA堿基序列間的堿基互補配對識別靶標基因并抑制靶標基因的表達? ?[1-2] 。

根據(jù)RNAi的原理，人為地在細胞內表達與靶標基因互補配對的具有回文結構的序列，利用細胞內源的RNAi元件，可以阻斷某個基因的表達或降低某個基因的表達量，引起細胞或組織內相應基因表達量下降，產生相應的表型。目前，RNAi技術已廣泛應用于基因的功能研究，具有較高特異性? ?[3-7] 。利用RNAi技術，可以選取基因特異性區(qū)段作為靶標，用于沉默特異的基因或基因家族中的單個或部分成員;也可以選取基因間的保守區(qū)段作為靶標，用于沉默某一類基因。

將具有發(fā)夾結構的雙鏈RNA的載體轉化到植物中能夠產生siRNA，并實現(xiàn)基因的沉默。常規(guī)構建發(fā)夾結構的方法是將靶標基因通過一段間隔序列連接，形成反向互補的核苷酸序列，由組成型啟動子或時空特性啟動子調控表達?，F(xiàn)有的RNAi載體的構建方法，一類是通過兩步法進行構建，包括酶切連接法、Gateway兼容的同源重組法等? [3-7] 。利用酶切連接法，首先將反向互補序列分別構建到中間載體，再利用限制性內切酶將反向互補序列從中間載體上切下來，連接到目的載體? [3，6-7] 。傳統(tǒng)的兩步法具有明顯的缺點，利用Gateway兼容的同源重組的方法，首先需要將反向互補序列分別構建到入門載體，再通過LR反應連入植物表達終載體? [4-5] ;酶切連接法不易設計合適的酶切位點，難以構建長片段RNAi載體。另一類是基于同源重組的一步法構建，即分別擴增2段反向互補片段、內含子片段，再與酶切后的植物表達載體進行四片段同源重組反應，然而實際操作中，多片段同源重組反應往往效率偏低，不能保證快速地成功構建RNAi載體。

USER 酶包含DNA糖基化酶-裂解酶 Endo ?VIII和尿嘧啶DNA糖基化酶（ UDG ），可特異性切割尿嘧啶。該酶可不依賴限制性內切酶和DNA連接酶將PCR產物裝載到目的載體? [8] 。目前使用 USER 酶進行一步法構建長片段RNAi載體尚未見相關報道。本研究以 PDS 基因為例，基于 USER 酶體系，將 PDS 基因片段構建到2301/RNAi/OS載體，利用煙草瞬時表達系統(tǒng)， 實現(xiàn) PDS 基因的沉默。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

用于載體構建的 USER 酶、限制性內切酶 Pac ?I和 Nt . Bbv C I購自New England Biolabs公司;用于目標片段擴增的高保真DNA聚合酶、用于大腸桿菌和農桿菌陽性轉化子篩選的 Taq ?DNA聚合酶預混液購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DNA純化試劑盒、RNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 質粒和菌株

用于植物表達的雙元載體質粒pCambia2301和2301.GFP4載體為本實驗室保存，用于擬南芥（ Arabidopsis thaliana ） ?FAD2? 基因? [9] 內含子克隆的pHurricane質粒為本實驗室保存，DH5 α 感受態(tài)細胞購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司，農桿菌（ Agrobacterium tumefaciens ）菌株GV3101感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司，瞬時轉化所用的本氏煙（ Nicotiana ??benthamiana ）種子由本實驗室保存。

1.3 引物合成和測序

本試驗所用引物（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。構建載體過程中的Sanger測序由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成。

1.4 試驗方法

1.4.1 2301/RNAi/OS載體的構建? 以pHurricane質粒為模板，利用引物Intron-CF和Intron-CR擴增 1 154 ?bp的擬南芥? FAD2? 基因內含子序列，用 Bam H I和 Xba ?I分別對? FAD2? 內含子的擴增產物和2301.GFP4載體進行雙酶切，1% 瓊脂糖凝膠電泳，分別切膠回收擴增片段和線性化載體片段，用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5 α 菌株的感受態(tài)細胞，挑取單菌落，利用引物 TEV -F和 FAD -R進行菌落PCR篩選，選取含有陽性擴增條帶的單菌落，提取質粒，測序驗證。

1.4.2 本氏煙的RNA提取和cDNA合成? 取產生表型的本氏煙葉片，在研缽中液氮速凍，研磨成粉末，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.4.3 2301/RNAi/OS- PDS 載體的構建? 以幼嫩煙草葉片的cDNA為模版，利用引物 PDS -F1和 PDS -F2擴增576 bp的 PDS 基因區(qū)段作為正向插入片段，利用引物 PDS -R1和 PDS -R2擴增與正向插入片段序列相同的區(qū)段作為反向插入片段。用限制性內切酶 Pac ?I和 Nt.Bbv C I將2301/RNAi/OS載體進行雙酶切，1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收線性化載體和? FAD2?? 內含子條帶。配制連接反應體系： PDS 正向片段150 ng， PDS 反向片段150 ng，2301/RNAi/OS酶切產物200 ng， USER 酶1 μl，補ddH ?2 O至10 μl。反應條件：37 ℃ 20 min ，25 ℃ 20 min，獲得連接產物，轉化到大腸桿菌DH5 α 菌株中。挑取單菌落，分別利用引物 TEV -F和 FAD -R，以及 FAD -F和 NOST -SR進行菌落PCR鑒定陽性克隆，提取質粒，進行測序驗證。

1.4.4 農桿菌介導的煙草瞬時轉化? 分別取100 ng 2301/RNAi/OS- PDS 質粒和2301/RNAi/OS質粒（作為空載體對照），利用電擊轉化法導入GV3101農桿菌菌株，涂布于固體LB培養(yǎng)基平板上（含有50 ?mg/ml 利福平和50 ?mg/ml 卡那霉素），28 ℃倒置培養(yǎng)36 h，挑取單菌落，利用引物 TEV -F和 FAD -R進行菌落PCR，挑取3個陽性單菌落，28 ℃振蕩培養(yǎng)36 h用于煙草瞬時表達。配制農桿菌侵染液（20 ml）：2 ??mol/L? ?MgCl ?2 ?15 μl， 1 ?mol/L ??pH ?5.7 MES 200 μl ，200 ?μmol/L 乙酰丁香酮100 μl，用超純水補足到20 ml。農桿菌? OD ??600 = 0.05，用1 ml無菌注射器將侵染液從煙草葉片背面注射到葉片內，每種質粒注射3個單株。

1.4.5 實時定量PCR反應? 反應體系： 2× 實時定量PCR預混液10.0 μl，10 ?μmol/L 引物 PDS -TF（或? EF1? -AF） 0.5 μl，10 ?μmol/L 引物 PDS -TR（或? EF1? -AF） 0.5 μl， 1∶ 30稀釋的cDNA 3.0 μl; 無離子水6.0 μl。反應程序： 95 ℃? 1 min; 94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個循環(huán);熔解曲線， 60～ 95 ℃，每0.1 ℃讀數(shù)1次。通過2? -△△ Ct? ?法分析基因表達差異? [10] 。

2 結果與分析

2.1 引物設計和植物表達載體構建

本試驗采用2301.GFP4作為骨架構建RNA載體2301/RNAi/OS。2301.GFP4為本實驗室改造，該載體以商業(yè)化的pCambia2301質粒作為骨架，在多克隆位點處順序連有含有 2× 花椰菜花葉病毒（CaMV）35S增強子的CaMV 35S啟動子、煙草蝕紋病毒（TEV）的翻譯增強子TEV leader序列? [11] 、增強型綠色熒光蛋白（eGFP）的編碼序列和35S終止子（圖1）。該載體以新霉素磷酸轉移酶（ NPTII ）基因作為篩選標記基因。

以pHurricane質粒為模板，擴增擬南芥? FAD2? 基因的內含子序列，通過引物在? FAD2? 內含子編碼序列上游和下游分別引入限制性內切酶（ Bam H I和 Xba ?I）位點，以便將? FAD2? 內含子編碼序列定向連入同樣用 Bam H I和 Xba ?I雙酶切的2301.GFP4載體中。同時在? FAD2? 內含子序列兩側，分別引入 Nt . Bbv C I- Pac ?I- Nt . Bbv C I酶切位點，使得所得載體在 Nt . Bbv C I- Pac ?I的作用下能夠形成含有9 nt黏性末端的載體片段。測序驗證正確的質粒命名為2301/RNAi/OS（圖1），即為本試驗構建的RNAi植物表達載體。后續(xù)只需擴增出目標基因的反向互補序列，即可通過 USER 酶介導的方法連入該載體。

2.2 煙草 PDS ?基因的瞬時沉默載體構建

為了驗證利用2301/RNAi/OS構建的RNAi載體能夠在植物中有效地實現(xiàn)基因沉默，我們選取本氏煙 PDS 基因作為靶標基因，通過農桿菌介導的瞬時轉化沉默 PDS 基因? [6] 。 PDS 突變體會表現(xiàn)出葉片白化失綠以及植株生長受抑制的表型，因而容易通過表型變化，直觀地觀察基因沉默情況。

35S promoter：花椰菜花葉病毒35S啟動子;dual enhancer：2×花椰菜花葉病毒35S增強子;TL：煙草蝕紋病毒翻譯增強子;MCS：限制性內切酶多克隆位點;eGFP：增強型綠色熒光蛋白;Ter：35S終止子;? FAD2?? intron：擬南芥? FAD2? 基因內含子。上部放大圖中的黑色豎線和折線表示相應限制性內切酶的切割位置。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中本氏煙的cDNA選取從編碼區(qū)121位到696位之間的576 bp的基因特異性區(qū)段作為靶標區(qū)段，分別設計2對引物（ PDS -F1和 PDS -F2， PDS -R1和 PDS -R2），以本氏煙幼苗葉片的cDNA為模板，分別擴增靶標區(qū)段。設計引物時，在引物中基因特異區(qū)段的5′側依次引入 USER 酶的識別堿基尿嘧啶（U）和特異的序列（表1），以便目標區(qū)段的PCR產物在 USER 酶作用后，可產生與2301/RNAi/OS酶切產物一致的9 nt的黏性末端。用 USER 酶處理2段含有靶標基因序列的PCR產物，以及 Pac ?I和 Nt.Bbv C I雙酶切的2301/RNAi/OS載體，反應后轉化大腸桿菌（圖2A）。挑取單克隆進行菌落PCR，鑒定兩段目標序列均連入2301/RNAi/OS載體的克隆。本試驗隨機挑取16個單菌落，2組引物均能擴增出陽性條帶的有13個菌落，正確率超過80%（圖2B、圖2C、圖2D）。選取2號和5號克隆，提取質粒，測序驗證，結果都正確，命名為2301/RNAi/OS- PDS -2和2301/RNAi/OS- PDS -5，后續(xù)選取2號質粒進行煙草瞬時表達試驗。

2.3 瞬時沉默本氏煙 PDS 基因

利用電擊法將質粒2301/RNAi/OS- PDS -2轉入農桿菌菌株GV3101的感受態(tài)細胞中，同樣利用 TEV -F和 FAD -R進行菌落PCR篩選。隨機挑取3個陽性克隆，接種于含有利福平、慶大霉素和卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和。離心收集菌體沉淀，利用煙草注射緩沖液重懸至終 OD ??600 =0.5，靜置活化后注射 4～ 5片平展的本氏煙葉片。以注射含有2301/RNAi/OS空載體的農桿菌的煙草作為對照。每隔2 d注射1次，共注射3次，于最后一次注射后10 d觀察煙草葉片表型。結果表明，注射含有2301/RNAi/OS空載體的農桿菌的葉片（對照）仍然保持綠色，并且能夠長出多片綠色新葉（圖3A）;而注射了含有2301/RNAi/OS- PDS -2質粒的農桿菌的煙草植株葉片明顯失綠，較老的葉片白化壞死，植株生長受到嚴重抑制（圖3B），呈現(xiàn)出典型的 PDS 基因功能缺失的表型。除了被注射的葉片失綠白化，沒有被注射的新葉的葉脈也可以觀察到明顯的白化表型。除了表型觀察，本試驗進一步進行了實時定量PCR，檢測 PDS 基因表達水平的變化。本試驗針對RNAi載體靶標序列以外的3′端區(qū)段設計引物，提取葉脈白化的新葉的總RNA反轉錄了后，檢測 PDS 基因表達水平，以煙草延伸因子基因（ ?EF1a? ）作為內參基因。結果表明，相比于對照，注射了含有2301/RNAi/OS- PDS -2質粒的農桿菌的煙草植株中 PDS 基因的表達水平下降20%（圖3C），這與相應葉片葉脈白化的表型相一致。以上結果表明，本試驗構建的RNAi載體可以有效地在植物體內實現(xiàn)基因沉默。

A： Pac ?I和 Nt.Bbv C I雙酶切后的2301/RNAi/OS載體和 USER 酶切后的 PDS 基因擴增產物混合后轉化大腸桿菌，涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上長出的單菌落;B：利用引物 TEV -F和 FAD -R進行菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳結果;C和D：利用引物 FAD -F和 NOST -SR進行菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳結果;M：DNA marker;數(shù)字1～16代表被測單克隆的編號。

A：注射含有空載體2301/RNAi/OS的農桿菌的煙草植株的表型（對照）;B：注射含有2301/RNAi/OS- PDS 質粒的農桿菌的煙草植株的表型。用白色的數(shù)字標注被注射的葉片，從基部計算第1片被注射的葉片計為1;C：實時定量PCR檢測對照和注射含有2301/RNAi/OS- PDS 質粒的農桿菌的煙草植株中 PDS 基因的相對表達水平。對照中 PDS 基因的相對表達水平被設為1，煙草延伸因子基因（? EF1a? ）被用作內參基因，誤差線表示3次重復的標準差。 PDS -RNAi代表2301/RNAi/OS- PDS -2質粒。

3 討 論

近年來，新近發(fā)展起來的基因編輯技術能夠相對容易地在多種植物中實現(xiàn)基因功能缺失突變? [12-16] 。但對于純合突變致死的基因，基因功能的徹底喪失可能導致純合體不能成活，影響后續(xù)表型和基因功能的分析。利用RNAi技術，可不同程度地降低靶標基因的表達，而不會徹底敲除目標基因，進而能夠在植株成活的情況下，研究基因功能。此外，對于序列相似性較高的基因家族，RNAi技術可高效地同時降低多個基因的表達，尤其是串聯(lián)重復的基因家族，通過雜交將多個單基因突變聚合在一起是幾乎不能達到的，這時候RNAi技術便更能體現(xiàn)出其優(yōu)勢。

目前在植物中，利用小RNA干擾基因表達主要有RNAi和人工微RNA（amiRNA）2種策略。與形成較長的具有發(fā)夾結構的雙鏈RNA前體不同，amiRNA的策略是選取較短（通常為21 nt）的1段與靶標基因互補的序列，同時借用植物內源存在的microRNA前體基因作為骨架構建載體，在植物中表達。一般來講，amiRNA策略在體內只產生一種小RNA，雖然可能有益于提高干擾的特異性，但干擾效率有時低于產生多段小RNA的RNAi策略。此外，不同的靶標序列對所使用的內源RNA骨架可能具有一定程度的選擇性。因而，RNAi相比于amiRNA仍具有自己的優(yōu)勢? [1] 。

本研究采用基于 USER 酶的一步法構建RNAi發(fā)夾結構的載體。該方法簡便高效，植物表達終載體一旦構建好，每次只需擴增2條反向互補的序列，再用 USER 酶處理，就可以與酶切后的終載體相連接。本研究以本氏煙 PDS 基因為例，構建 PDS 基因的2條反向重復序列，成功構建了RNAi載體，載體構建成功率超過80%。 USER 酶可產生比普通酶切位點更長的黏性末端，且不需要DNA連接酶的作用即可完成連接，快速、穩(wěn)定、高效。與LIC連接方法? [17] 相比，本研究報道的方法成功率更高，操作更簡便。

本研究利用農桿菌介導的本氏煙瞬時表達系統(tǒng)驗證該載體的沉默效果，結果表明，利用該載體可以有效沉默煙草 PDS 基因，使注射含有2301/RNAi/OS- PDS -2質粒的農桿菌的煙草葉片明顯失綠，植株生長明顯受到抑制。有意思地是，除了直接注射的葉片失綠黃化，沒有直接注射的新生葉片的葉脈也表現(xiàn)出明顯的白化表型，并且 PDS 基因的表達水平降低到對照的80%。這可能是小RNA可以在細胞間移動導致的? [2，18] 。這一現(xiàn)象表明，農桿菌介導的瞬時RNA干擾能夠在一定程度上實現(xiàn)系統(tǒng)性的基因沉默。

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（責任編輯：陳海霞）