張鈺麟，陳泓帆，趙志平,2, ，康馨樾，聶 鑫，白 婷，王 衛(wèi)，張佳敏，羅淮良

（1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，四川成都 610106；2.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都 610500；4.自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠，四川自貢643101）

大頭菜又名芥菜，是醬腌菜常用原料，是四川四大醬腌菜之一，深受人們的喜愛。大頭菜具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、糖類、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等。在綠色蔬菜中，大頭菜的蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高，且富含維生素A、維生素C和胡蘿卜素。大頭菜每100 g可食部分含蛋白質(zhì)8.7 g、脂肪0.7 g、粗纖維素2.7 g、碳水化合物19.5 g、鈣214 mg、磷49 mg、鐵8.2 mg[1]。大頭菜具有潤腸通便、促進消化、利尿消腫等功效[2]。大頭菜生食味辣，熟化后味苦，腌制后的大頭菜口感脆爽，入口咸香，回味甘甜，具有獨特的風(fēng)味，受到消費者青睞。

大頭菜中的硫代葡萄糖苷可在分解后促進人體吸收，Macleod等[3]認為大頭菜中由硫代葡萄糖苷產(chǎn)生的異硫氰酸酯是大頭菜中的重要香氣物質(zhì)。洪冰等[4]比較接種發(fā)酵和自然發(fā)酵的大頭菜風(fēng)味發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)高于自然發(fā)酵。郭壯等[5]使用電子舌測得不同地區(qū)傳統(tǒng)大頭菜的滋味，發(fā)現(xiàn)腌制大頭菜的滋味差異來源于咸味、后味B和酸味三個指標。溫度是影響食品風(fēng)味形成的重要因素[6-7]。洪冰[8]研究發(fā)現(xiàn)，大頭菜最適發(fā)酵溫度為27 ℃，此溫度下發(fā)酵的大頭菜的滋味更加鮮美，香氣更加純正濃郁。蘇揚等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，泡菜的風(fēng)味形成與乳酸發(fā)酵、乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵有關(guān)[9]。乳酸菌是大頭菜腌制過程中的主要優(yōu)勢菌[10]，在中溫環(huán)境下，容易過酸和過熟。低溫可使發(fā)酵緩慢，細菌代謝周期長，代謝過程反應(yīng)完全[11]。低溫發(fā)酵在酸奶、面包、果酒等中都有較多研究和應(yīng)用。低溫發(fā)酵可使泡白菜揮發(fā)性成分豐富，風(fēng)味比中溫發(fā)酵的泡白菜更佳[12]。歐陽晶等[13]對臘八豆進行低溫發(fā)酵，通過測定不同時期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，證實了低溫發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)與傳統(tǒng)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)成分基本相同，但低溫可使風(fēng)味物質(zhì)聚集更加穩(wěn)定，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。鄧山鴻[14]在臍橙果酒的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫發(fā)酵有助于平衡酒體中各香氣成分。楊仁琴[15]比較了低溫長時間發(fā)酵和短時常規(guī)發(fā)酵酸乳，發(fā)現(xiàn)低溫長時間發(fā)酵酸乳的乙醛和乙?；衔锖扛?，風(fēng)味更佳。綜上所述，低溫對發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味形成與聚集有較大的正向影響。

傳統(tǒng)大頭菜多為高鹽常溫腌制，在腌制過程中使用了大量的鹽，腌制后需用大量的清潔水脫鹽，不僅增加了生產(chǎn)成本，而且?guī)砹艘欢ǔ潭鹊沫h(huán)境污染，并且脆度較低。此外，傳統(tǒng)大頭菜產(chǎn)品含鹽量較高，不符合當(dāng)下低鹽化消費理念。低溫腌制可解決傳統(tǒng)大頭菜腌制用鹽量高、造成環(huán)境污染和脆度低的技術(shù)難題。本研究在SPME-GC-MS的基礎(chǔ)上，結(jié)合ROAV值和PCA分析了工業(yè)化生產(chǎn)的不同低溫腌制（-1～5 ℃和6～8 ℃）大頭菜的風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，以期為工業(yè)化低溫大頭菜腌制工藝的優(yōu)化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫腌制大頭菜 自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠提供。

BCD-452WDPF冷藏冰箱 青島海爾集團；5977A-7890B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（含PAL3自動進樣器） 美國安捷倫公司；賽多利斯萬分之一天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫腌制大頭菜加工工藝 將大頭菜用冷水清洗，去除泥沙和根須后進行自然風(fēng)干20～40 d；自然風(fēng)干后，將大頭菜進行分切成2～3 mm厚連接手撕片；分切后，利用60±2 ℃的水進行清洗和浸泡10 min，然后把大頭菜取出利用熱風(fēng)振動機在35～40 ℃條件下熱風(fēng)振動15 min，將大頭菜干燥。將大頭菜和鹽（2.5%～3%）放入攪拌機，慢速攪拌3～9 min，裝入500 kg壇子，裝滿后在0～5 ℃條件下腌制1～2 d，進行第一次腌制。完成后，將大頭菜取出，再次放入攪拌機，并且加入4%的糖和0.5%～1.5%的鹽，慢速攪拌3～9 min，完成后取出；將大頭菜裝入50 kg壇子，裝滿密封后放入冷庫中分別進行-1～5 ℃和6～8 ℃低溫腌制60 d，以此樣品作為半成品進行風(fēng)味分析。半成品經(jīng)過調(diào)味后加工為成品，低溫腌制是大頭菜自身風(fēng)味的形成階段，故采用此階段的樣品進行風(fēng)味分析。

1.2.2 GC-MS檢測 取-1～5 ℃和6～8 ℃低溫腌制大頭菜，大頭菜中間部位寬度為1 cm，切碎成粒徑大約為1 mm的顆粒；稱取3 g顆粒置于15 mL的頂空瓶中密封，設(shè)置CTC自動進樣器對樣品的前處理條件如下：加熱箱溫度75 ℃，加熱時間45 min，樣品抽取時間20 min，解析時間5 min。

色譜條件：參照張旭的方法，稍作改進[16]。HP-5MS UI色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；壓力32.0 kPa；流速1.0 mL/min；載氣為H e氣，不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃保持1 min，以5 ℃ /mi n升至8 0℃，再以 3℃ /min升至160 ℃，保持1 min，再以20 ℃ /mi n升至200 ℃保持1 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；檢測器電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍（m/z）50550。

定性：對化合物進行分析，將得到的數(shù)據(jù)在儀器的NIST 14.L譜庫中進行檢索和匹配，選擇匹配度高于80%的物質(zhì)。參考已報道的文獻對各色譜峰進行人工解譜并且結(jié)合保留指數(shù)（RI），取正構(gòu)烷烴（C10～C25）混標，參照上述方法進行GC-MS分析；利用每個正構(gòu)烷烴的保留時間，結(jié)合公式計算待測組分的RI值。

式中：n為碳原子數(shù)；tx為待測組分的保留時間min；tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴保留時間，min tn+1為碳原子數(shù)為n +1的正構(gòu)烷烴保留時間，min。

定量：對總離子流量色譜圖用峰面積歸一化定量，得出各組分的相對含量。

1.2.3 特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的評價 為了評價各種揮發(fā)性物質(zhì)對樣品風(fēng)味的影響，采用相對氣味活度法（ROAV法）[17]，使得樣品風(fēng)味貢獻程度最大的物質(zhì)ROAVs=100，樣品中其他風(fēng)味物質(zhì)的ROAV值可通過以下公式計算：

式中：ROAVa是揮發(fā)性物質(zhì)的相對氣味活度值；C%a為各揮發(fā)性成分的相對含量；C%stan為對樣品風(fēng)味貢獻程度最大物質(zhì)的相對含量；Tstan為對樣品風(fēng)味貢獻程度最大物質(zhì)的感官閾值；Ta為各揮發(fā)性成分的感官閾值。對于所有的風(fēng)味物質(zhì)，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV＜1，對樣品的風(fēng)味起修飾作用；ROAV≥1的物質(zhì)為樣品的主體風(fēng)味物質(zhì)，對樣品的風(fēng)味貢獻顯著。ROAV值越大，則說明此物質(zhì)對樣品風(fēng)味貢獻越大。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并且以各種風(fēng)味物質(zhì)作為變量，采用IBM SPSS Statistics 25.0進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定分析

使用SPME-GC-MS對兩種不同新型低溫腌制大頭菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，其色譜圖結(jié)果如圖1所示。

腌制溫度的不同使得兩種低溫腌制大頭菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類以及含量都有所差異。-1～5 ℃低溫腌制的大頭菜風(fēng)味物質(zhì)包含醇類物質(zhì)3種、酯類物質(zhì)3種、烯類物質(zhì)1種、腈類物質(zhì)1種、酮類1種、醚類1種，平均相對含量分別為2.46%、23.11%、1.90%、5.88%、23.65%、1.20%。6～8 ℃低溫腌制的大頭菜風(fēng)味物質(zhì)包含醇類物質(zhì)6種、酯類物質(zhì)3種、烯類物質(zhì)2種、腈類物質(zhì)1種、醛類物質(zhì)1種、酸類物質(zhì)1種、酮類物質(zhì)1種、醚類物質(zhì)1種，平均相對含量分別為12.11%、16.65%、3.86%、3.52%、0.23%、0.38%、1.46%、1.20%。

腌制溫度升高后，大頭菜中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)上升的趨勢。兩種大頭菜共有的揮發(fā)性物質(zhì)包括芳樟醇、苯乙醇、桉葉油醇、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、2-苯乙基異氰酸酯、對二甲苯、D-檸檬烯、3-甲基異噻唑、茴香腦、2,4,6-三甲基吡啶、左旋樟腦、1-苯基-3-（2-羥乙基）硫脲、苯代丙腈。苯乙醇、異硫氰酸仲丁酯、4-異丙基甲苯、2-正戊基呋喃為-1～5 ℃低溫腌制大頭菜所獨有的風(fēng)味物質(zhì)；苯乙醇具有強烈的果香、異硫氰酸仲丁酯廣泛存在于芥末、蘿卜、山葵中，其只在-1～5 ℃中被檢出，能夠賦予-1～5 ℃低溫腌制大頭菜獨特的芥末、橡膠氣味[18]，十字花科蔬菜加工產(chǎn)品中辛辣風(fēng)味是由原料中硫代葡萄糖苷在加工過程中，因細胞破損而在硫代葡萄糖酶催化下水解產(chǎn)生異硫氰酸酯類所賦予[19]，Blazevic等[20]利用GC-MS技術(shù)對青海月桂種子揮發(fā)性分解產(chǎn)物異硫氰酸酯進行了定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)溫度越高使異硫氰酸酯含量越低，這與本研究結(jié)果相似。6～8 ℃低溫腌制大頭菜中未檢出異硫氰酸酯，可能是因為硫代葡萄酶因溫度升高而逐漸失活。3-甲基異噻唑相對含量由-1～5 ℃低溫腌制大頭菜中的23.65%下降到6～8 ℃低溫腌制大頭菜中的1.46%；其是一種肉類香精，香味特征為烤肉香[21]，主要是美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物和含硫氨基酸降解產(chǎn)物之間發(fā)生反應(yīng)[22]。1-辛烯-3-醇、4-萜烯醇、α-松油醇、螺[2.4]庚-4,6-二烯、P-傘花烴、1-亞甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己烷、壬酸、苯乙醛、甲氧基苯肟、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇甲酸酯是6～8 ℃低溫腌制大頭菜特有的風(fēng)味物質(zhì)。亞油酸在脂肪氧合酶催化下產(chǎn)生過氧化氫，經(jīng)脫氫成酮再被酶轉(zhuǎn)化成1-辛烯-3-醇，賦予6～8 ℃低溫腌制大頭菜獨特的蘑菇香氣[23]。朱羽堯等[24]通過對大紅袍芳香物質(zhì)含量及組成分析發(fā)現(xiàn)，4-萜烯醇和桉葉油醇的含量受溫度影響較大，比較兩種物質(zhì)化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)，4-萜烯醇可通過自身環(huán)化反應(yīng)從而生成桉葉油醇。壬酸作為6～8 ℃低溫腌制大頭菜唯一酸類物質(zhì)，能夠賦予其油香，有研究證實壬酸可在級聯(lián)酶的作用下，由不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化而來[25]。通過對上述檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分類以及采用峰面積歸一法計算各種風(fēng)味物質(zhì)的相對含量，結(jié)果如表1所示。

表1 低溫腌制大頭菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量Table 1 Varieties and contents of volatile flavor compounds in kohlrabi pickled at low temperature

2.2 主體風(fēng)味物質(zhì)的ROAV分析

樣品的總體風(fēng)味往往是由相對含量以及感官閾值共同決定的。相對含量高并且感官閾值低的物質(zhì)對樣品整體風(fēng)味貢獻較大。但是不同化合物的閾值不同，某些相對含量較低的物質(zhì)由于閾值較低也對樣品風(fēng)味貢獻較大[27]。參考文獻[16,28]以及結(jié)合《化合物嗅覺閾值匯編》，共找到17種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的感官閾值（見表2），分別計算兩種低溫腌制大頭菜每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量對感官閾值的比值，比較大小后可以定義苯代丙腈為-1～5 ℃低溫腌制大頭菜風(fēng)味貢獻最大的物質(zhì)（ROAV=100），1-辛烯-3醇為6～8 ℃低溫腌制大頭菜中風(fēng)味貢獻最大的物質(zhì)（ROAV=100）。結(jié)合相對含量以及感官閾值，采用ROAV法對兩種大頭菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，以進一步確定關(guān)鍵性的風(fēng)味物質(zhì)。兩種大頭菜中的風(fēng)味物質(zhì)ROAV值如表2所示。

表2 大頭菜揮發(fā)性物質(zhì)相對氣味活度值Table 2 Relative odour activity value of volatile flavor compounds in low-temperature pickled mustard roots

兩種低溫腌制大頭菜一共確定12種關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)，其中-1～5 ℃低溫腌制大頭菜共有9種，分別為異硫氰酸仲丁酯、2-正戊基呋喃、D-檸檬烯、桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醇、苯代丙腈、茴香腦、2-苯基乙基異硫代氰酸酯。6～8 ℃低溫腌制大頭菜共有10種，分別為1-辛烯-3-醇、D-檸檬烯、桉葉油醇、苯乙醛、芳樟醇、苯乙醇、苯代丙腈、壬酸、茴香腦、2-苯基乙基異硫代氰酸酯。

醇類物質(zhì)為兩種低溫腌制大頭菜主要的風(fēng)味物質(zhì)，主要由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生[29]，多來源于不飽和脂肪酸的氧化降解。醇類物質(zhì)的感官閾值較高，但是對香氣的組成起關(guān)鍵性作用，可以與有機酸發(fā)生酯化反應(yīng)，從而生成可賦予食品果香以及甜香的酯類物質(zhì)[30]。腌制溫度升高后，醇類物質(zhì)呈現(xiàn)上升的趨勢。1-辛烯-3醇隨著溫度的升高在6～8 ℃低溫腌制大頭菜中被檢出，且ROAV=100，說明1-辛烯-3醇是6～8 ℃低溫腌制大頭菜中風(fēng)味貢獻較大的物質(zhì)之一。另外，桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醇也對兩種低溫腌制大頭菜的風(fēng)味貢獻較大，它們分別呈現(xiàn)出樟腦香、花香、焦香-杏仁香。

腈類物質(zhì)是十字花科蔬菜特有的揮發(fā)性風(fēng)味成分[31-32]，它是通過芥子酶的催化活性降解硫代葡萄糖苷而產(chǎn)生的[33-34]。苯代丙腈作為唯一腈類物質(zhì)在兩種低溫腌制大頭菜中ROAV值都偏大，其在-1～5 ℃大頭菜中ROAV為100、在6～8 ℃低溫腌制大頭菜ROAV為32.89。它是-1～5 ℃低溫腌制大頭菜貢獻率最大的風(fēng)味物質(zhì)。

異硫氰酸酯是兩種大頭菜中主要的酯類物質(zhì)，是一種化學(xué)刺激物，具有獨特的特性，可引起熱感、灼熱感和刺激性氣味[35-36]。劉璞等發(fā)現(xiàn)榨菜腌制品自身的香氣主要來自于異硫氰酸酯類以及腈類物質(zhì)[37]。

2.3 關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

采用主成分分析法區(qū)分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。提取ROAV ≥1的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)，根據(jù)特征值不小于1的原則，得出兩個主成分，如表3所示。兩個主成分的貢獻率分別為85.33%、12.40%，累計貢獻率為97.73%。主成分分析累計貢獻率一般達到80%，就可以代表絕大部分信息[38]。

表3 主成分特征值及貢獻率Table 3 Principal component characteristic value and contribution rate

表4 是因子載荷矩陣，它反映的是各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對兩個主成分的重要程度。對PC1貢獻較大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有苯乙醇、桉葉油醇、1-辛烯-3-醇、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、異硫氰酸仲丁酯、D-檸檬烯、壬酸、苯乙醛、2-正戊基呋喃、苯代丙腈；對PC2貢獻較大的有芳樟醇、D-檸檬烯、茴香腦、苯乙醛。

表4 載荷矩陣Table 4 Load matrix

以PC1（85.33%）、PC2（12.40%）建立主成分載荷圖以及兩種大頭菜的得分圖（圖2），兩個主成分可以反映全部信息的97.73%，提取較為全面。所有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分布在第一象限、第二象限、第四象限。離橫坐標越遠則說明對主成分1的貢獻越大，離縱坐標越遠的點對主成分2的貢獻越大。苯乙醇是對主成分1貢獻最大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，呈現(xiàn)出果香、玫瑰香氣[39]。壬酸、1-辛烯-3醇也是對主成分1貢獻較大的風(fēng)味物質(zhì)，1-辛烯-3醇又稱蘑菇醇[40]呈現(xiàn)出強烈的蘑菇-壤香[21]。此外，1-辛烯-3醇還可以作為醫(yī)藥原料[41]，壬酸呈現(xiàn)出油香味。因此，第一主成分主要反映大頭菜的果香、蘑菇香以及油香。對第二主成分（12.40%）貢獻較大的揮發(fā)性物質(zhì)有茴香腦、芳樟醇、D-檸檬烯，它們分別呈現(xiàn)大茴香、鈴藍香、花香氣，所以第二主成分主要反映的是大頭菜的茴香、鈴藍香以及花香。由圖2B可知，兩種低溫腌制大頭菜在PC1以及PC2上得分具有差異，說明腌制溫度的升高導(dǎo)致低溫腌制大頭菜風(fēng)味有所改變。-1～5 ℃低溫腌制大頭菜與PC2呈高度正相關(guān)，6～8 ℃大頭菜與PC1呈高度的正相關(guān)。

圖2 大頭菜主成分載荷圖（A）及兩種腌制溫度大頭菜的得分圖（B）Fig.2 Principal component load diagram and scores of lowtemperature pickled mustard roots

3 結(jié)論

SPME-GC-MS分析和ROAV值數(shù)據(jù)表明，-1～5 ℃和6～8 ℃低溫腌制大頭菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括醇類、酯類、烯類和腈類，6～8 ℃低溫腌制大頭菜較-1～5 ℃低溫腌制大頭菜的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)更多。腈類是-1～5 ℃低溫腌制大頭菜貢獻最大的風(fēng)味物質(zhì)，而醇類是6～8 ℃低溫腌制大頭菜貢獻最大的風(fēng)味物質(zhì)。PCA分析表明腌制溫度升高導(dǎo)致低溫腌制大頭菜風(fēng)味發(fā)生改變?；诖x組學(xué)和微生物多樣性分析揭示溫度影響低溫腌制大頭菜風(fēng)味形成的機理將成為未來研究重點方向。本研究為工業(yè)化生產(chǎn)低溫腌制大頭菜生產(chǎn)工藝的進一步優(yōu)化提供了理論依據(jù)。