朱九超 虞堅(jiān)頤 白藝蘭 周立晨 孫泉云 趙洪進(jìn)*

(1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海，201103；2.上海動(dòng)物園，上海，200335)

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種全球范圍內(nèi)流行的人獸共患寄生蟲病[1]。剛地弓形蟲是機(jī)會(huì)性致病寄生蟲，能感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?，多?shù)人與動(dòng)物在感染后無顯著癥狀，但對(duì)于免疫功能低下或受限人群以及先天感染的嬰兒，感染易導(dǎo)致嚴(yán)重疾病甚至致命[2]。包括家貓(Felissilvestriscatus)在內(nèi)的貓科(Felidae)動(dòng)物是剛地弓形蟲的唯一終末宿主，它們通過攝入緩殖子、速殖子或卵囊感染，又通過糞便排出卵囊污染環(huán)境和水體，成熟卵囊被其他動(dòng)物攝入后引起感染[3]，是弓形蟲傳播中最重要的一環(huán)。

針對(duì)多地動(dòng)物園的研究發(fā)現(xiàn)，多種圈養(yǎng)野生動(dòng)物會(huì)感染弓形蟲，其中貓科動(dòng)物與其他動(dòng)物相比有更高的感染率[4]。張述義等[5]曾對(duì)上海動(dòng)物園52種117只圈養(yǎng)野生動(dòng)物開展過血清弓形蟲抗體檢測(cè)，總體陽性率37.7%(ELISA法)，研究發(fā)現(xiàn)食肉類(Carnivora)動(dòng)物(尤其是貓科動(dòng)物)弓形蟲感染率在各組動(dòng)物大類中最高。該研究還發(fā)現(xiàn)1例新近感染的赤猴(Erythrocebuspatas)病例，推測(cè)其可能是因攝入環(huán)境中的弓形蟲卵囊而發(fā)病。雖然動(dòng)物園環(huán)境中的流浪貓被認(rèn)為是造成圈養(yǎng)貓科動(dòng)物及其他易感動(dòng)物感染的最主要傳播途徑之一[6]，但同類研究中僅涉及少量流浪貓樣本，亦或主要針對(duì)家養(yǎng)環(huán)境中的寵物貓，有關(guān)動(dòng)物園園區(qū)內(nèi)流浪貓弓形蟲感染狀況的監(jiān)測(cè)研究較少。本研究通過對(duì)上海動(dòng)物園園區(qū)內(nèi)流浪貓開展弓形蟲抗體和病原檢測(cè)，旨在摸清園區(qū)內(nèi)弓形蟲感染情況和潛在風(fēng)險(xiǎn)，為園區(qū)弓形蟲病防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2019年11月—2020年5月，在上海動(dòng)物園內(nèi)流浪貓頻繁活動(dòng)覓食區(qū)域設(shè)誘捕籠點(diǎn)，捕獲流浪貓103只。每只靜脈采集血液樣本2—4 mL，全血保存于-80℃，備測(cè)。3 500 r/min離心10 min分離得血清，保存于-20℃，備測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

采用磁珠法(MagMAXTMMicrobiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit)于全自動(dòng)工作平臺(tái)(KingFisher Duo Prime)提取全血樣本核酸，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)弓形蟲B1基因特異性片段，試劑盒購(gòu)自廣州維伯鑫生物科技有限公司，檢測(cè)方法與結(jié)果判定均按試劑盒操作說明施行，簡(jiǎn)述如下：將試劑盒置室溫使熒光PCR預(yù)混液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照完全溶解，并混勻。取20 μL熒光PCR預(yù)混液和1 μLTaq酶至每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)，然后加入提取好的病毒核酸、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各4 μL，每個(gè)反應(yīng)總體積為25 μL。按以下反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)置：95℃ 10 min；94℃ 15 s；55℃ 30 s(收集熒光)；40個(gè)循環(huán)。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清樣本中的弓形蟲抗體IgG，弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自法國(guó)愛迪威(IDVET)公司，檢測(cè)方法與結(jié)果判定均按試劑盒操作說明施行，簡(jiǎn)述如下：取10 μL待測(cè)樣本、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入96孔檢測(cè)板對(duì)應(yīng)位置；每孔加入90 μL Diltion Buffer 2進(jìn)行稀釋；室溫孵育45 min后甩干，用配置好的wash solution清洗3次；分別加入100 μL配制好的conjugate工作液；室溫孵育30 min后甩干檢測(cè)板，用配置好的wash solution清洗3次；分別加入100 μL substrate solution，室溫環(huán)境下避光孵育15 min；再分別加入100 μL終止液，并立即于450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用非參檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)對(duì)不同區(qū)域、不同采樣季節(jié)流浪貓感染率差異進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 弓形蟲分子生物學(xué)檢測(cè)

對(duì)采集的103份血液核酸樣本采用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增弓形蟲B1基因特異性片段，結(jié)果均為陰性。

2.2 血清弓形蟲抗體IgG檢測(cè)

對(duì)其中有效的95份血清樣本進(jìn)行弓形蟲抗體IgG檢測(cè)，結(jié)果得陽性樣本49份，總體陽性率51.6%，公園各區(qū)域流浪貓陽性率與S/P值見表1。

表1 上海動(dòng)物園流浪貓弓形蟲血清抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Seroprevalences of antibody to Toxoplasma gondii of feral cats in Shanghai Zoo

2.3 區(qū)域和采樣月份對(duì)流浪貓血清抗體S/P值的影響

采用K-W檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述不同的8個(gè)區(qū)域間流浪貓血清抗體S/P值無顯著差異(P=0.555)，不同月份間(11—5月)流浪貓血清抗體S/P值(表2)無顯著差異(P=0.903)。

表2 上海動(dòng)物園流浪貓不同月份弓形蟲血清抗體S/P值Tab.2 S/P values of sero antibody to Toxoplasma gondii of feral cats in Shanghai Zoo in different months

3 結(jié)論與討論

本研究共檢測(cè)上海動(dòng)物園流浪貓103只，血液核酸樣本未檢出弓形蟲抗原。95份血清樣本檢出弓形蟲IgG抗體49份，總體陽性率51.6%，明顯高于相關(guān)研究中我國(guó)城市寵物貓(如深圳市4.68%[7]、上海市14.5%[8])、美國(guó)動(dòng)物園(29.4%)[6]和土耳其伊茲密爾(35.6%)[9]。陽性率最高區(qū)域?yàn)殪`長(zhǎng)動(dòng)物區(qū)(83.3%)，最低為兩棲爬行類區(qū)與獸醫(yī)院(40.0%)，不同區(qū)域、不同月份間流浪貓血清抗體S/P值差異未達(dá)顯著水平。

貓科動(dòng)物是弓形蟲的終末宿主，是弓形蟲傳染鏈中的最主要源頭，在弓形蟲感染狀況監(jiān)測(cè)與防控中應(yīng)當(dāng)作為重要指示物種[4]。因?yàn)橛辛己玫沫h(huán)境、穩(wěn)定的食物來源，且人類干擾少，流浪貓易在動(dòng)物園聚集和繁衍。本研究動(dòng)物園流浪貓抗體陽性率在區(qū)域和時(shí)間上均無顯著差異整體趨同，反映貓科動(dòng)物雖為獨(dú)居動(dòng)物，有相對(duì)固定的活動(dòng)范圍，但在本園區(qū)流浪貓個(gè)體間弓形蟲有較高的傳播效率。圈養(yǎng)野生動(dòng)物相關(guān)研究顯示，靈長(zhǎng)目中新大陸猴類如松鼠猴(Saimirisciureus)、狐猴類如環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)均是弓形蟲高度易感物種[10-11]，染病的澳洲有袋目(Marsupialia)動(dòng)物也有較高的致死率[12]。環(huán)尾狐猴母體的弓形蟲經(jīng)由胎盤組織感染胎兒，導(dǎo)致先天性感染和死胎[13]，國(guó)內(nèi)廣州動(dòng)物園也有環(huán)尾狐猴感染弓形蟲死亡的報(bào)告[14]。我國(guó)江西省內(nèi)動(dòng)物園7種39只圈養(yǎng)動(dòng)物檢出弓形蟲血清抗體總陽性率為17.9%(IHA法)，包括長(zhǎng)頸鹿(Giraffacamelopardalis，27.3%)、小天鵝(Cygnuscolumbianus，22.2%)和狼(Canislupuslaniger，20.0%)等[15]。福州動(dòng)物園27種110只動(dòng)物中檢出15種動(dòng)物血清抗體陽性(MAT法)，總陽性率22.7%[16]。上述研究表明，圈養(yǎng)野生動(dòng)物因其生活環(huán)境與飼養(yǎng)方式，極易暴露于弓形蟲傳染鏈中，成為易感群體[17]。本研究中靈長(zhǎng)區(qū)流浪貓抗體陽性率與S/P均值均在各區(qū)域中最高(83.3%、88.4%)，提示其傳播弓形蟲的風(fēng)險(xiǎn)較高，這些流浪貓?jiān)诟鱾€(gè)展區(qū)間活動(dòng)，對(duì)開放/半開放展區(qū)中的圈養(yǎng)動(dòng)物極易引起感染風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)引起重視。

在動(dòng)物園環(huán)境中弓形蟲病傳染源、傳染途徑多，易感物種種類繁多。動(dòng)物園又是一個(gè)人類、圈養(yǎng)動(dòng)物、野生動(dòng)物交互頻繁的地區(qū)，在這樣的場(chǎng)所開展弓形蟲病防控必須掌握傳播源頭與傳播鏈，明確群體感染狀況，因此對(duì)流浪貓、圈養(yǎng)貓科動(dòng)物等重要指示性動(dòng)物開展持續(xù)性常態(tài)化監(jiān)測(cè)，將為弓形蟲病在圈養(yǎng)野生動(dòng)物中的防控提供科學(xué)依據(jù)。