樊清艷，鄭亞強(qiáng)，葛文超，李冰超，陳 斌,5

(1.黔西南州興義市林業(yè)局，貴州 興義 562400；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) ，貴州 貴陽 550025； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 江蘇 南京 210095；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

1 引言

馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaeaoperculell(Zeller))又名煙草潛葉蛾，俗名順筋蟲、串皮蟲等，隸屬于鱗翅目(Lepidotera)，雙孔亞目(Ditrysia)，麥蛾總科(Gelechioidea)，麥蛾科(Gelechiidae)，塊莖蛾屬(Phthirimaea)[1]。該蟲廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲、非洲、大洋洲、中美及南美洲[2]，主要以馬鈴薯、煙草、番茄和辣椒等茄科作物為食，對馬鈴薯的危害尤其嚴(yán)重[3～5]。

昆蟲腸道是昆蟲的消化中心，其間孕育著大量微生物，這些微生物在宿主腸道中發(fā)揮了不同的功能，影響了宿主的生理活動。目前，關(guān)于昆蟲腸道細(xì)菌與宿主營養(yǎng)指標(biāo)的研究已有一些相關(guān)的報道，Indiragandhi 等[6]探究小菜蛾(P.xylostella)腸道10種細(xì)菌對寄主營養(yǎng)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)能促進(jìn)幼蟲的生長和發(fā)育。De-Vries等[7]對西花薊馬Frankliniellaoccidentalis研究，發(fā)現(xiàn)宿主腸道細(xì)菌減少了宿主的成熟時間而提高了宿主昆蟲的產(chǎn)卵率。藍(lán)波妙[8]對斜紋夜蛾(S.litura)的研究，發(fā)現(xiàn)利用抗生素處理斜紋夜蛾腸道細(xì)菌，影響了宿主的消化能力，其相對生長率、相對取食量、食物利用率都顯著的下降，重新導(dǎo)入腸桿菌和全部腸道細(xì)菌后，其各項營養(yǎng)指標(biāo)又趨于恢復(fù)，表明斜紋夜蛾腸道細(xì)菌影響了宿主的取食消化能力。因此，弄清昆蟲腸道細(xì)菌與宿主營養(yǎng)指標(biāo)的關(guān)系尤為重要。葉片和塊莖作為馬鈴薯的兩種不同器官，二者間組成成分不同，馬鈴薯塊莖蛾既能取食馬鈴薯葉片，又能取食馬鈴薯塊莖，樊清艷等[9]利用可培養(yǎng)法從取食馬鈴薯塊莖的馬鈴薯塊莖蛾腸道內(nèi)分離獲得細(xì)菌4門8科10屬15種，從取食馬鈴薯葉片的馬鈴薯塊莖蛾腸道內(nèi)分離獲得細(xì)菌4門11科11屬16種。然而，對于取食馬鈴薯塊莖和葉片的馬鈴薯塊莖蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌與宿主營養(yǎng)指標(biāo)的關(guān)系還尚未清楚。

據(jù)報道，測定植食性昆蟲的營養(yǎng)指標(biāo)在一定程度上不僅可以直觀地反映昆蟲對食料的偏好和適應(yīng)程度，也是目前研究植食性昆蟲與食物關(guān)系的常用方法[10，11]。因此，本研究采用重量法分析腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾三齡幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的影響。一方面不僅可以直觀反映昆蟲腸道細(xì)菌對宿主取食消化的影響，另一方面可以探究宿主能夠有效利用食物中的營養(yǎng)成分提供有效途徑。因此，研究腸道細(xì)菌對宿主食性具有深遠(yuǎn)而重要的意義。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 蟲源的飼養(yǎng)

選取直徑為15 cm的培養(yǎng)皿，其上鋪一層濕潤的濾紙，放入清洗干凈的麗薯6號馬鈴薯葉片，接入初孵幼蟲10頭，用保鮮膜封住培養(yǎng)皿，用昆蟲針在保鮮膜上扎孔，置于溫度為25±2 ℃，相對濕度65%～75%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3齡幼蟲備用。

2.1.2 供試馬鈴薯葉片

供試馬鈴薯品種為麗薯6號馬鈴薯，由云南省曲靖市會澤縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供。將麗薯6號馬鈴薯種植于45 cm×50 cm花盆中，待植株長到30 cm時，采集健康、無病蟲害的葉片清洗備用。

2.1.3 供試菌株

粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)、嗜鹽谷氨酸桿菌(Glutamicibacterhalophytocola)、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcussuccinus)和阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae)。

2.2 方法

2.2.1 馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌的培養(yǎng)

將分離于馬鈴薯塊莖蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌：粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)、嗜鹽谷氨酸桿菌(G.halophytocola)、糞產(chǎn)堿菌(A.aecalis)、琥珀葡萄球菌(S.succinus)和阿氏腸桿菌(E.asburiae)分別接種培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，150 r/min搖床24 h，3000 r/min離心3 min，用無菌水稀釋至OD600=1.0。

2.2.2 抗生素處理馬鈴薯塊莖蛾

配置濃度為1 mg/mL環(huán)丙沙星、1 mg/mL左氧氟沙星和2 mg/mL甲硝唑混合的抗生素混合溶液，將馬鈴薯葉片浸泡于抗生素混合溶液中10 min，取出自然風(fēng)干后，放入直徑為15 cm的無菌培養(yǎng)皿中，選取50頭健康的馬鈴薯塊莖蛾三齡幼蟲于無菌培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封住培養(yǎng)皿口，用昆蟲針在保鮮膜上扎孔，置于溫度為25±2 ℃，相對濕度65%～75%的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)24 h后，饑餓處理6 h，稱其鮮重。用無菌水浸泡馬鈴薯葉片飼喂馬鈴薯塊莖蛾為對照處理，所有處理均重復(fù)三次。

2.2.3 馬鈴薯塊莖蛾幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的測定

將馬鈴薯葉片分別浸泡于OD600=1.0的粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)、嗜鹽谷氨酸桿菌(G.halophytocola)、糞產(chǎn)堿菌(A.faecalis)、琥珀葡萄球菌(S.succinus)和阿氏腸桿菌(E.asburiae)菌液中10 min，取出自然風(fēng)干后，置于無菌培養(yǎng)皿中，挑取50頭飼喂過抗生素的馬鈴薯塊莖蛾于無菌培養(yǎng)皿中飼養(yǎng)48 h。每隔24 h換一次不同菌液浸泡過的馬鈴薯葉片，用無菌水浸泡過的馬鈴薯葉片做對照，所有試驗均重復(fù)三次。飼喂48 h后取出未被取食的食物，將馬鈴薯塊莖蛾幼蟲饑餓處理6 h。然后將馬鈴薯塊莖蛾幼蟲、糞便和剩余食物在80 ℃下烘10 h至干燥，分別稱其干重。計算食料的干濕比、飼養(yǎng)幼蟲的干鮮比和馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的相對生長率、相對取食量、食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率和近似消化率。

2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013和SPSS 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計和處理，并參照藍(lán)波妙的方法計算馬鈴薯塊莖蛾的營養(yǎng)指標(biāo)[32]，其計算公式如下：

相對生長率(%)=G/(B*T)

(1)

相對取食量=I/(B*T)

(2)

食物利用率(%)=G/I*100

(3)

食物轉(zhuǎn)化率(%)=G/(I-F)*100

(4)

近似消化率(%)=(I-F)/I*100

(5)

公式(1)～(5)中，G為蟲體增重(即G=飼后幼蟲干重-飼前幼蟲干重)；I為幼蟲的取食量(即I=飼前食物干重-飼后食物干重)；F為排泄物(糞便)干重；B為實驗期間幼蟲的平均體重(即B=(飼前幼蟲干重+飼后幼蟲干重)/2)；T為實驗天數(shù)。

3 結(jié)果與分析

馬鈴薯塊莖蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對宿主幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的影響見表1。由表1可知，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)、嗜鹽谷氨酸桿菌(G.halophytocola)、糞產(chǎn)堿菌(A.faecalis)、琥珀葡萄球菌(S.succinus)和阿氏腸桿菌(E.asburiae)處理的食物，跟對照組相比，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲在24 h和48 h的相對生長率、相對取食量和對食物的消化率都有提高，但食物利用率和食物轉(zhuǎn)化率均降低。其中，取食琥珀葡萄球菌處理的食物對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲在24 h和48 h的相對生長率、相對取食量和近似消化率三個營養(yǎng)指標(biāo)提高最顯著，而食物利用率和食物轉(zhuǎn)化率最低(圖1)。表明馬鈴薯塊莖蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食有顯著的促進(jìn)作用。其中，琥珀葡萄球菌對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的取食消化具有更好的適應(yīng)性。

表1 不同菌株對馬鈴薯塊莖蛾營養(yǎng)指標(biāo)的測定

續(xù)表1

圖1 琥珀葡萄球菌對馬鈴薯塊莖蛾營養(yǎng)指標(biāo)的影響

4 討論

昆蟲腸道中棲居著大量的微生物，這些微生物影響宿主昆蟲的生長發(fā)育、取食消化、抗藥性等生理活動。因此，研究腸道微生物對昆蟲營養(yǎng)指標(biāo)的測定不僅能夠直接反映腸道微生物在宿主昆蟲腸道中發(fā)揮的作用，同時為探究宿主昆蟲能夠有效利用食物中的營養(yǎng)成分提供有效途徑。Indiragandhi等[13]發(fā)現(xiàn)，小菜蛾(P.xylostella)腸道中粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)能促進(jìn)幼蟲的生長和發(fā)育。De等[7]發(fā)現(xiàn)，Erwinia.sp縮短了西花薊馬(F.occidentalis)的成熟時間而提高了宿主昆蟲的產(chǎn)卵率。夏曉峰[14]發(fā)現(xiàn)，腸桿菌(Enterococcus.sp)提高了小菜蛾(P.xylostella)對毒死蜱的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖蛾腸道內(nèi)的粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescen)、嗜鹽谷氨酸桿菌(G.halophytocola)、糞產(chǎn)堿菌(A.aecalis)、琥珀葡萄球菌(S.succinus)和阿氏腸桿菌(E.asburiae)對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食有顯著的促進(jìn)作用。其中，琥珀葡萄球菌(S.succinus)對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的取食消化有更好的適應(yīng)。該結(jié)果進(jìn)一步表明昆蟲腸道細(xì)菌影響了宿主的取食消化能力，對宿主昆蟲的取食具有較好的適應(yīng)。

本研究利用重量法研究腸道細(xì)菌對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲營養(yǎng)指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對生長率、相對取食量和近似消化率3個營養(yǎng)指標(biāo)均提高，但食物利用率和食物轉(zhuǎn)化率均降低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有二：其一是食用抗生素處理的食物后，使馬鈴薯塊莖蛾腸道細(xì)菌的菌群發(fā)生了紊亂，消化生理發(fā)生了改變，飼喂馬鈴薯塊莖蛾腸道產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶細(xì)菌處理的食物后，恢復(fù)對馬鈴薯塊莖蛾消化功能的代謝作用；其二是馬鈴薯塊莖蛾通過機(jī)體內(nèi)部生理調(diào)節(jié)結(jié)果，低的食物轉(zhuǎn)化率和利用率可能是對取食量高一種生理平衡，高的食物轉(zhuǎn)化率可能是對低消化率的一種生理補(bǔ)償[15]。褚世海等[16]、郭婷婷等[17]對黑點切葉野螟(H.basalis)和二點委夜蛾(A.epigone)的研究也有類似的結(jié)果。