陳 璐，張小麗，高 柱，盧玉鵬，王小玲

（1江西省科學院生物資源研究所，南昌 330096；2井岡山生物技術(shù)研究院/江西省科學院井岡山分院，江西吉安 343016）

0 引言

中國是稀土資源大國，作為世界稀土中心，稀土儲量位居世界首位，稀土含量約占世界總儲量的23%，占世界總產(chǎn)量的90%以上[1-2]。稀土元素因其獨特的理化性質(zhì)，對植物生長具有一定的生理調(diào)控特性，同時稀土離子還可與細胞質(zhì)膜上的生物大分子結(jié)合形成比較穩(wěn)定的復合物，增強氧化酶活性以及減少電解質(zhì)外滲，改變細胞膜的通透性和穩(wěn)定性，降低膜脂過氧化過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，提高細胞膜的保護功能與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，從而增強植物對逆境的抵御能力[3-4]。其中，稀土元素鑭在地球上的蘊藏量較高，同時其化學性質(zhì)活潑、水合離子半徑小且對植物生長負面影響小，已被確認為作物的生理活性物質(zhì)，在調(diào)控作物生長、產(chǎn)量和品質(zhì)方面表現(xiàn)出“低促進高抑制”的影響作用，即適宜濃度處理時，可打破種子休眠促進萌發(fā)、促進生長發(fā)育、提高作物產(chǎn)量、改善果實品質(zhì)、增強植物抗性、緩解不利脅迫等作用[5-7]；當處理濃度較高時，植物體內(nèi)蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性受到抑制，干物質(zhì)含量與葉綠素含量下降，抑制了根莖葉的生長，同時鑭的重金屬特性也會抑制作物體內(nèi)特定酶的活性和結(jié)合蛋白，進而產(chǎn)生毒害作用，對作物造成傷害[8]。

稀土和臍橙是江西贛南地區(qū)的主要經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)，贛南地區(qū)也因此享有“稀土王國”與“中國臍橙之鄉(xiāng)”的美譽，臍橙在中國柑橘類水果中占據(jù)著重要地位，主栽品種‘紐荷爾’臍橙(Citrussinensis(L.)Osbeck‘Newhall’)的種植面積占全國種植面積的85%以上[9-11]。大量研究表明贛南臍橙風味濃厚、品質(zhì)上乘，與土壤中的稀土含量關(guān)系密切，稀土含量較高的土壤更有利于臍橙果實中營養(yǎng)物質(zhì)的形成、積累[12-13]。然而，稀土元素在果樹上的應用研究主要集中在提高果園產(chǎn)量、改善果實品質(zhì)和增強果樹抗性等方面[14-15]，針對稀土鑭元素對‘紐荷爾’臍橙滲透調(diào)節(jié)影響的生理機制研究的報道較少。滲透調(diào)節(jié)(Osmotic adjustment)是指植物體因低溫、高溫、干旱、鹽堿等逆境導致的水分脅迫下，植物體內(nèi)通過主動積累細胞內(nèi)的無機離子或細胞合成的有機溶質(zhì)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高細胞液濃度，降低滲透勢，提高細胞吸水或保水能力，是植物適應逆境脅迫的重要生理過程，許多研究表明植物通過主動積累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等分子量小、容易溶解的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細胞的滲透平衡與正常的生理代謝[16]。

本研究以‘紐荷爾’臍橙為試驗材料，采用不同濃度的硝酸鑭溶液噴施處理葉片，通過測定處理后1天當中不同時間(0～24 h)葉片滲透物質(zhì)含量變化規(guī)律，探討稀土元素鑭對臍橙葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響的作用機理，為進一步研究稀土元素對臍橙生理代謝的調(diào)控以及預防稀土元素鑭的環(huán)境毒理效應提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2年生‘紐荷爾’臍橙嫁接苗，于2020年2月移栽至直徑為60 cm的花缽中，每盆栽植1棵幼苗。供試盆栽土壤采自江西省科學院園藝植物高值利用研究基地（海拔64.35 m，28°40'17''N、115°18'31''E），每盆裝10 kg土壤，裝盆后進行移栽并進行合理的田間管理。

1.2 試驗方法

2020年7月中旬，選擇晴朗天氣，于上午8:00噴施4種不同濃度的硝酸鑭溶液：0、50、150、300 mg/L，以0 mg/L處理作為對照(CK)。每個處理噴施5棵幼苗，3次重復。分別于當天上午噴施前8:00和噴施后10:00、12:00、16:00、20:00和次日上午8:00（以下記錄為處理時間：0、2、4、8、12、24 h）采集植株中上部當年生嫩葉。每個處理采集的葉片剪碎，混勻后，液氮迅速冷凍，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 滲透物質(zhì)含量測定

采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，于620 nm測定其吸光值[17]，采用考馬斯亮藍G-250染色法(Coomassie brilliant blue G-250)測定可溶性蛋白含量[18]，采用酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[19]，采用島津UV-8000S紫外可見分光光度計進行分析測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)取3次重復試驗的平均值，利用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硝酸鑭對臍橙葉片可溶性糖含量的影響

可溶性糖是作物細胞中調(diào)節(jié)滲透平衡的小分子有機化合物，具有維持細胞滲透平衡和細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性等重要生理功能。圖1表明，處理的24 h之內(nèi)，臍橙葉片可溶性糖含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。其中，當硝酸鑭處理濃度為50 mg/L時，葉片可溶性糖含量降低最快，處理12 h后降低了44.17%，處理24 h后降低了47.50%；當硝酸鑭處理濃度為150 mg/L和300 mg/L時，葉片可溶性糖含量降低比較緩慢，處理12 h后分別降低了22.39%與19.74%，處理24 h后分別降低了42.82%與36.16%。另外，隨著硝酸鑭處理濃度增大，葉片平均可溶性糖含量積累增加，50 mg/L、150 mg/L和300 mg/L處理后，葉片平均可溶性糖含量顯著高于CK，分別是CK的1.06倍、1.11倍和1.12倍；且150 mg/L和300 mg/L處理對促進葉片可溶性糖含量積累的作用差異不明顯。由此表明，硝酸鑭處理雖然不能改變臍橙葉片可溶性糖含量積累的趨勢，但是可以明顯促進葉片可溶性糖含量的積累，降低細胞液滲透勢，以此適應外界變化。

圖1 不同濃度的硝酸鑭對臍橙葉片中可溶性糖含量的影響

2.2 不同濃度硝酸鑭對臍橙葉片可溶性蛋白含量的影響

在硝酸鑭處理的0～24 h期間，臍橙葉片中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢（圖2）。當硝酸鑭處理濃度為50 mg/L時，葉片可溶性蛋白含量峰值出現(xiàn)的時間與CK相同，均在處理后4 h達到，分別是處理前的2.45倍和2.02倍；當處理濃度為150 mg/L與300 mg/L，葉片可溶性蛋白含量峰值出現(xiàn)的時間在處理后8 h，較對照延遲了4 h，分別是處理前的1.90倍和2.29倍。進一步分析表明，當硝酸鑭處理濃度為50 mg/L和150 mg/L時，臍橙葉片可溶性蛋白平均含量顯著高于CK，分別是對照的1.32倍和1.20倍；當處理濃度為300 mg/L時，臍橙葉片可溶性蛋白含量顯著低于CK，是對照的0.66倍。可見，隨著硝酸鑭處理濃度增大，臍橙葉片可溶性蛋白平均含量降低，因此促進臍橙葉片可溶性蛋白含量增加的適宜硝酸鑭濃度為≤150 mg/L。

圖2 不同濃度的硝酸鑭對臍橙葉片中可溶性蛋白含量的影響

2.3 不同濃度硝酸鑭對臍橙葉片游離脯氨酸含量的影響

脯氨酸積累是作物應對逆境脅迫的生理表現(xiàn)之一。本研究首先表明不同硝酸鑭濃度處理后臍橙葉片中游離脯氨酸含量的變化趨勢和CK不盡相同（圖3）。其中，CK呈逐漸下降趨勢；50 mg/L處理呈先下降后上升的趨勢，處理后4 h游離脯氨酸含量達到最低值(619.79 mg/L)，是處理0 h時的0.64倍，隨后其含量開始增加，處理后24 h的含量也只為0 h時的0.91倍；150 mg/L與300 mg/L處理均呈先上升后下降的趨勢，但是2個處理后游離脯氨酸含量峰值出現(xiàn)的時間不同。150 mg/L處理于4 h時出現(xiàn)最峰值(1039.88 mg/L)，是處理0 h的1.25倍，處理4 h之后，葉片游離脯氨酸含量迅速下降，處理24 h后僅為0 h時的0.57倍；300 mg/L處理脯氨酸含量于8 h時出現(xiàn)積累高峰(1410.84 mg/L)，峰值出現(xiàn)時期比150 mg/L的處理延遲了2 h，隨后其含量下降速率由慢轉(zhuǎn)快，處理后12 h時為0 h時的1.29倍，24 h時是0 h時的1.06倍。其次，50 mg/L、150 mg/L和300 mg/L硝酸鑭處理后，臍橙葉片游離脯氨酸積累含量均顯著高于CK，分別是CK的1.79倍、1.66倍和2.67倍。因此，硝酸鑭處理不僅增強了滲透脅迫下臍橙葉片中游離脯氨酸含量的積累，而且適宜臍橙葉片游離脯氨酸含量積累的硝酸鑭處理濃度≥300 mg/L，具體濃度還有待進一步研究。

圖3 不同濃度的硝酸鑭對臍橙葉片中游離脯氨酸含量的影響

3 結(jié)論與討論

受到脅迫（鹽脅迫、重金屬脅迫等）或處于逆境中（高溫、干旱等）會導致植物細胞失水，細胞內(nèi)外滲透壓失衡，而滲透調(diào)節(jié)是植物抵御外界脅迫或逆境平衡細胞滲透壓的重要生理反應，并且滲透調(diào)節(jié)還具有維持葉片氣孔開放與正常光合作用、調(diào)節(jié)蒸騰與呼吸等生理作用[20]?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍着c游離脯氨酸含量等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是影響植物滲透調(diào)節(jié)的重要指標，滲透物質(zhì)的積累可以調(diào)節(jié)細胞與外界的滲透壓平衡，保護細胞膜與蛋白質(zhì)活性，以此維持細胞的正常生理功能[21-22]。

許多研究表明，可溶性糖是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)劑，植物在逆境脅迫下會積累可溶性糖，平衡細胞內(nèi)外的滲透勢，降低質(zhì)膜的損傷程度，通過提高植株的保水能力來增強植物的抗性[23]。作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，也可以為合成其他有機物提供碳骨架和能量，保持細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[24]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度硝酸鑭處理臍橙葉片后其可溶性糖含量高于CK，可能是由于硝酸鑭的加入導致在正常代謝過程中大分子碳水化合物分解加快而合成緩慢，光合產(chǎn)物形成過程中加快了小分子量蔗糖的合成[20]，這也說明臍橙葉片通過主動積累滲透物質(zhì)可溶性糖，調(diào)節(jié)細胞滲透壓，以此適應由硝酸鑭處理引起的外界環(huán)境變化，提高植株在逆境脅迫條件下的抗性。

可溶性蛋白是植物體內(nèi)抵抗逆境脅迫的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，植物細胞在應對逆境脅迫時往往通過主動積累大量可溶性蛋白來增加細胞滲透壓，維持細胞膨壓平衡[25]。楊光梅[4]研究發(fā)現(xiàn)，適當濃度的鑭離子可提高植物體內(nèi)保護酶活性，減少電解質(zhì)的外滲，降低膜脂過氧化程度，從而增強植株對逆境或脅迫的抵御能力。本研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鑭與CK處理的臍橙葉片在不同生長時間，其可溶性蛋白含量先上升后下降，處理4 h或8 h后均開始下降，這也說明生長過程中臍橙葉片蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，分解速率加快，合成速率減慢，進而導致蛋白質(zhì)含量逐漸減少。當硝酸鑭處理濃度為50 mg/L和150 mg/L時，對臍橙葉片滲透物質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)含量積累的促進作用較強；當處理濃度為300 mg/L時，產(chǎn)生明顯的抑制作用，這與前人得到的“高抑低促”的結(jié)論一致[26]，即適宜的濃度可以提高植物對環(huán)境變化或脅迫的適應能力，而過高的濃度則會抑制滲透調(diào)劑物質(zhì)的積累，導致滲透失衡。與此同時，300 mg/L硝酸鑭處理是唯一1個處理24 h葉片中可溶性蛋白含量低于0 h的含量，再次證明了高濃度硝酸鑭不僅抑制可溶性蛋白的積累，而且對葉片造成的滲透脅迫已超出了其自我修復和調(diào)節(jié)能力，說明促進臍橙葉片可溶性蛋白含量積累的硝酸鑭適宜濃度為≤150 mg/L。

脯氨酸水溶性大、分子量小、對細胞無損害影響，是氨基酸中最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是植物抵御逆境的重要有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[27]。一方面游離脯氨酸積累的多少反映著植物葉片受脅迫傷害程度的大小，另一方面作為親和性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持著細胞內(nèi)外的滲透平衡，甚至可能直接影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，對生物大分子的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性起一定保護作用[28]。隨著硝酸鑭濃度的增加，臍橙葉片中游離脯氨酸含量的積累也不斷增多，可能是外界鑭離子刺激加快了脯氨酸的合成效率或（且）抑制了脯氨酸氧化作用的緣故[20]，體現(xiàn)外界鑭離子刺激了滲透溶質(zhì)不斷積累，并參與了滲透調(diào)節(jié)，通過提高脯氨酸的含量維持細胞的滲透平衡，以此抵御脅迫。

大量研究表明，適宜的硝酸鑭濃度可以促進植物通過主動積累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等有機小分子物質(zhì)來提高細胞液濃度，降低細胞內(nèi)的滲透勢，維持細胞膨壓以及植物的正常生理功能[29-30]；而鑭離子濃度過高時，鑭的重金屬特性顯現(xiàn)，對植株的損傷超出了植物的自我調(diào)節(jié)能力，造成了細胞滲透壓失衡，不僅抑制植株生長，而且影響植物體內(nèi)酶的活性和結(jié)合蛋白，甚至對植株產(chǎn)生毒害作用。本研究結(jié)果表明，50 mg/L的硝酸鑭處理與CK的葉片可溶性糖、可溶性蛋白與游離脯氨酸含量均在相同的時間出現(xiàn)積累高峰，同時這三者在積累高峰時的含量均高于CK；150 mg/L的硝酸鑭處理相較于CK，對葉片中可溶性糖、可溶性蛋白與游離氨基酸含量的積累均有促進作用；300 mg/L的硝酸鑭處理雖然促進了可溶性糖與游離氨基酸含量的積累，但抑制了可溶性蛋白含量的積累，推測是由于滲透物質(zhì)種類不同而引起的差異。

綜上所述，臍橙葉片通過主動積累可溶性糖、可溶性蛋白與游離脯氨酸來適應和調(diào)節(jié)硝酸鑭處理造成的細胞滲透脅迫?？扇苄蕴桥c脯氨酸含量在50 mg/L、150 mg/L與300 mg/L硝酸鑭處理后均促進積累，而可溶性蛋白含量在50 mg/L與150 mg/L硝酸鑭處理后促進積累，但在300 mg/L處理下積累受到抑制，呈現(xiàn)“高抑低促”的現(xiàn)象。適宜濃度的硝酸鑭通過促進臍橙葉片中可溶性糖、可溶性蛋白與游離脯氨酸的積累，維持細胞滲透壓平衡，提高細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，增強植株對環(huán)境變化或脅迫的適應與抵御能力；而硝酸鑭濃度過高，抑制可溶性蛋白的積累，并對葉片造成傷害。由于滲透物質(zhì)種類不同，促進臍橙葉片可溶性糖與脯氨酸積累的適宜濃度應為≥300 mg/L，而促進可溶性蛋白積累的適宜濃度為≤150 mg/L。關(guān)于硝酸鑭促進臍橙葉片不同滲透物質(zhì)積累的最佳濃度可在此研究基礎(chǔ)上深入研究。