劉 霞，張 哲，錢紅潔，張利杰，楊艷麗

（1云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明 650201；2云南省植物病理重點實驗室，昆明 650201）

0 引言

馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害之一，每年都有不同程度的發(fā)生和流行，已成為制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素[1]。近幾年來，全球每年因致病疫霉菌引起的馬鈴薯晚疫病所造成的損失不可估量[2]，而云南省是中國馬鈴薯主產(chǎn)地之一，其致病疫霉菌具有多樣性、致病性強等特點。目前對馬鈴薯晚疫病菌的致病機理也未完全了解，基于此，探索由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病致病機制，為以后防治晚疫病奠定基礎。半胱氨酸蛋白酶是一類在酶的活性中心含有半胱氨酸并受巰基反應基不可逆抑制的蛋白水解酶，廣泛存在于人類、哺乳動物、植物、原生動物、真菌、細菌、病毒等生物體內，共有49個家族[3]。植物中大部分屬于木瓜蛋白酶亞家族和豆類天冬氨酸蛋白內切酶亞家族，還有天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶亞家族和鈣依賴半胱氨酸蛋白酶亞家族，之后還發(fā)現(xiàn)催化蛋白去泛素化的泛素類半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶體[4-5]。半胱氨酸蛋白酶參與植物中某些細胞沉積和降解貯存蛋白，非生物脅迫和生物脅迫的響應，啟動子中常含有脅迫響應元件，但在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中發(fā)現(xiàn)tdi-65只受干旱誘導，而不受ABA誘導[6]。半胱氨酸蛋白酶是植物體重要的蛋白水解酶[4,7]，廣泛參與對生物和非生物脅迫的響應[8]、參與植物體的衰老和細胞程序性死亡[9-10]、貯存蛋白的沉積和降解[11-12]等生理過程。半胱氨酸蛋白酶也參與植物生物節(jié)律的調節(jié)，近年來發(fā)現(xiàn)可能具有轉錄因子的作用。木瓜蛋白酶(Papain-like cysteine proteases,PLCPs)是C1A家族蛋白酶，是其中最具代表性、研究最為廣泛深入的一種蛋白酶[13]。最初是在木瓜的乳汁和果實中得到的4類木瓜蛋白酶，隨后在病毒、細菌、原生動物、真菌、動物和植物中被發(fā)現(xiàn)。這類蛋白酶在酸性pH條件下發(fā)揮活性。在植物半胱氨酸蛋白酶中，papain蛋白酶研究較多。其中擬南芥發(fā)現(xiàn)有32個編碼papain型的半胱氨酸蛋白酶，主要分為：aleurain型、KDEL型、類actinidain型、類菠蘿蛋白酶型、末端序列型、類組織蛋白酶B型、受衰老和逆境誘導型[14]。在酶前體會形成α螺旋和β折疊結構域，結構域之間會構成裂隙，裂隙底部為催化活性位點[15]，在保守區(qū)內其4個催化活性位點分別是Gln-Cys-His-Asn/Asp[16-17]，這也是papain蛋白酶的結構特點。酶前體分為2種，一種有EX3RX3FX2NX3IX3N(ERFNIN)花式，另一種無花式，還有的成員N端酶前體序列中含有液泡靶向信號NPIR，papain型繞過高爾基體而與蛋白貯存液泡直接融合[18]。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已發(fā)表超過50個類papain植物蛋白酶，對甜蕎半胱氨酸蛋白酶基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因能被干旱、高鹽、ABA和衰老脅迫誘導[19]，但在致病疫霉中未見報道。實驗室前期研究以云南省致病疫霉菌不同生理小種的3個菌種為試驗材料，通過提取純化3個致病疫霉菌的代謝產(chǎn)物，進行雙向電泳檢測，用液質聯(lián)用質譜分析，得到了3個菌種共有的16個蛋白[20]。本試驗對其中假定能引起毒害的登錄號為gi|262108704的半胱氨酸蛋白酶家族基因進行克隆及基因功能分析，對原核表達產(chǎn)物活性進行測定，并明確原核表達蛋白能否引起馬鈴薯葉片的壞死，確定該蛋白是否參與馬鈴薯晚疫病的侵染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 馬鈴薯品種 供試馬鈴薯品種為‘大西洋’，植株不抗晚疫病。

1.1.2 病菌樣本 本研究使用的病菌樣本為XH05-5-4，其生理小種為2.4.8.9.10，由云南農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯研究室保存提供。

1.1.3 分子生物學試劑 反轉錄試劑盒TransScript?II Frist-Stand cDNA Synthesis SuperMix、克隆載體pEASY?-T1Cloning Kit、原核表達載體pEASY?-E1Expression Kit均購自北京全式金生物公司，切膠回收試劑盒TARAKA MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0購自大連寶生物工程公司，高純度質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 半胱氨酸蛋白酶家族C1A基因克隆ZH05-5-4菌株總RNA按照Trizol試劑說明進行，反轉錄按照試劑盒說明書進行。以蛋白編號為gi|262108704（登錄號NW_003303706）的核苷酸序列為模版，利用Primer5.0軟件設計引物F(5’-TGTTCAAGGCTGAGGGTG-3’)、R(5’-AGTTGGCTACATTCCATTCG-3’)，PCR反應條件 為 94℃ 變性 7 min，94℃ 40 s，57.4℃ 40 s，72℃1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收按照試劑盒進行，并連接到pEASY?-T1載體上，轉入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐青霉素、X-gel篩選，隨機選取獨立的陽性克隆子，用通用引物做菌落PCR檢測，并送上海華大基因公司測序鑒定，對樣品進行備份。

1.2.2 序列分析 用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)程序預測等電點及分子量；NetNGlyc Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)工具預測氨基酸序列中可能存在的糖基化位點[20-21]；ProtScale預測不同肽段的親水性疏水性變化 ；NPS@（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）對蛋白質二級結構進行預測[22]；用TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0)工具預測蛋白質跨膜結構,SingalP預測信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[20]。

1.2.3 原核表達 將反轉錄cDNA的切膠回收產(chǎn)物和pEASY?-E1Expression Kit進行連接，轉化到感受態(tài)細胞Trans1-T1，經(jīng)抗性篩選后挑取陽性單克隆子，接種至含Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600為0.5～0.8時提取質粒，導入BL21中，菌落PCR檢測，取1 mL作為未誘導的陰性對照，同時建立空載體對照，向剩余培養(yǎng)液加入IPTG（終質量濃度為1 mg），37℃、220 r/min分別誘導2、4、6、12 h后各取菌液1 mL，離心10 min收集菌體，加入1 mL SDS凝膠加樣緩沖液重懸，沸水浴，取上清液SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物誘導情況，將誘導后的樣品離心后重溶于PBS緩沖液，超聲波破碎，再離心后留上清液備用。將菌液接種馬鈴薯品種‘大西洋’離體葉片，以無菌水和空載體作為對照組，對蛋白生物活性進行測定。

2 結果與分析

2.1 半胱氨酸蛋白酶家族C01A基因克隆

2.1.1 PCR擴增產(chǎn)物 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到長約1000 bp的cDNA片段，切膠回收后連接克隆載體pEASY?-T1后進行菌落PCR檢測，獲得目的片段（圖1）。片段長度為1176 bp，最大的開放閱讀框1077 bp（圖2），編碼387個氨基酸。蛋白相對分子量41.671 kD，等電點4.88，說明蛋白呈酸性，該基因含Ser(S)最多，占10.0%，不含Asx(B)、Glx(Z)、Xaa(X)?？偟膸д婞c殘基(Arg+Lys)為29，負電殘基(Arg+Glu)為41，其脂溶指數(shù)為75.77，不穩(wěn)定系數(shù)41.91，為不穩(wěn)定蛋白。

圖1 PCR擴增圖譜M:DNA marker(DL2000);1:目的片段

圖2 半胱氨酸蛋白酶基因最大ORF核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

2.1.2 同源性分析 經(jīng)BLAST分析，半胱氨酸蛋白酶家族C01A基因核苷酸編碼區(qū)序列與Genbank登錄號為XP_002896821.1的核苷酸序列同源性為99%，與登錄號為XM_008906598.1的核苷酸同源性為86%，與登錄號為XM_004348520.1的核苷酸同源性為90%。對半胱氨酸蛋白酶家族C01A基因的氨基酸序列進行BlastP分析發(fā)現(xiàn)其在保守區(qū)域與其他半胱氨酸蛋白酶具有較高的相似性，其中與PhytophthorainfestansT30-4 cysteine protease familyC01A同源性最高，利用SMART在線工具對蛋白質的結構域進行預測，發(fā)現(xiàn)C1A-PH-SCH1編碼的氨基酸在143～357位具有Pept-C1結構域，可推斷C1A-PH-SCH1屬于木瓜蛋白酶亞家族。

2.2 生物學信息學分析

2.2.1 信號肽預測 利用SingaIP進行信號肽預測顯示，蛋白第1～18個氨基酸殘基為其信號肽（圖3），信號肽的裂解位點在第18位的丙氨酸。

圖3 信號肽預測

2.2.2 糖基化位點分析 利用NetNGlyc 1.0 Server預測其在第138、283位含有N-糖基化位點。

2.2.3 親水性疏水性分析 利用ProtScale預測不同肽段的親水性疏水性變化，結果表明：第5～23位的氨基酸均為疏水性，而第8、9位的亮氨酸(L)疏水性最強，第287位的Gln(Q)親水性最強，但親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，整個蛋白可能表現(xiàn)親水性（圖4）。

圖4 親水性/疏水性預測結構

2.2.4 跨膜結構預測 TMHMM2.0預測該蛋白有跨膜螺旋結構，具有跨膜結構（圖5）。

圖5 跨膜螺旋結構預測

2.2.5 蛋白二級結構預測 通過NPS@對基因進行蛋白質二級結構預測，結果顯示：α-螺旋(H)含量為28.21%；無規(guī)則卷曲(C)含量為41.62%；而β轉角(T)含量僅為9.78%；延伸鏈€含量為20.39%（圖6）。

圖6 二級結構

2.3 原核表達載體的檢測

目的片段與表達載體pEASY?-E1連接后導入T1感受態(tài)中，經(jīng)涂板挑取陽性菌導入BL21后，經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃下分別誘導2、4、6、12 h重組蛋白的表達，誘導完成后收集菌絲，對上清進行SDSPAGE電泳檢測（圖7），以空載體和沒有經(jīng)IPTG誘導的菌液蛋白做對照，結果表明，在誘導6 h后，發(fā)現(xiàn)41.67 kDa有1條明顯條帶，對照組不明顯，表明外源蛋白在大腸桿菌中得到表達，原核表達載體構建成功。

圖7 IPTG誘導大腸桿菌表達C1A-PH-SCH1重組蛋白的SDS-PAGE電泳結果

2.4 外源表達蛋白生物活性測定

將原核表達的蛋白稀釋成3個濃度接種馬鈴薯品種‘大西洋’的離體葉片，1周后供試葉片出現(xiàn)與晚疫病癥狀類似的壞死斑，對照組正常（圖8）。因此可以推測C1A-PH-SCH1參與馬鈴薯晚疫病的發(fā)病過程。

圖8 生物活性測定

3 討論

木瓜蛋白酶參與了植物對逆境的反應[20,21,24]，植物衰老[22,25]及植物細胞程序化死亡[23,26]，Lee等發(fā)現(xiàn)OsCP1基因參與水稻雄性不育過程[24,27]；zhang等[25,28]在煙草花藥中反義抑制NtCP56的表達，導致煙草花粉粒敗育；嚴秀蕊等從水稻中克隆了OsCP2基因[26,29]；王高峰在馬鈴薯腐爛莖線蟲中克隆了L型半胱氨酸蛋白酶[27,30]；張曉梅等發(fā)現(xiàn)NtCP56在反義RNA介導的轉基因煙草花藥中絨氈層的降解延遲從而導致花粉發(fā)育異常[25,28]；趙冬梅等報道PcFiSCR.1對馬鈴薯和煙草葉片有毒害作用，而PcFiSCR.1富含小的半胱氨酸的分泌蛋白，含有保守的半胱氨酸序列和N-末端信號肽[28,31]，還有大量報道稱半胱氨酸蛋白酶家族是植物的凋亡或編程性細胞死亡的效應器等，在植物中半胱氨酸蛋白酶能引起植物的壞死，但在致病疫霉菌中未見有相關報道。所以本試驗對致病疫霉中的分泌蛋白進行了生物活性測定，重組蛋白誘導表達結果顯示當pEASYE1在BL21 DE3中表達，得到了很好的表達，在未誘導、誘導2、4 h均未看見有明顯的條帶，在6、8、12 h處蛋白出現(xiàn)大量的表達。本研究對木瓜蛋白酶進行生物活性測定的結果顯示，葉片出現(xiàn)水漬狀壞死斑的癥狀，而空載體、無菌水均未出現(xiàn)壞死癥狀，所以初步判斷半胱氨酸蛋白酶家族對馬鈴薯有毒害作用，推測C1APH-SCH1參與了致病疫霉引起馬鈴薯晚疫病的過程。本試驗采用原核表達系統(tǒng)，對于初步篩選蛋白毒性具有培養(yǎng)條件簡單、基因操作容易、從構建到產(chǎn)物純化周期短、成本低、產(chǎn)量高等特點。為后續(xù)對毒性蛋白進行基因定位，致病機理研究等工作奠定基礎。

4 結論

本試驗利用TA克隆技術從致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1個半胱氨酸蛋白酶家族基因（登錄號：KP938956命名：C1A-PH-SCH1），編碼387個氨基酸。通過同源性比對發(fā)現(xiàn)C1A-PH-SCH1為木瓜蛋白酶亞家族基因，成功構建了原核表達載體，并使其在大腸桿菌中得到了表達，對生物活性測定結果顯示出現(xiàn)了類似于晚疫病癥狀的水漬壞死斑癥狀，推測C1A-PHSCH1參與馬鈴薯晚疫病的發(fā)病過程。

生物學信息分析表明該蛋白為分泌蛋白，并且該蛋白存在一個N-糖基化位點，表明該蛋白翻譯產(chǎn)生信號肽，當轉譯進行到第18位氨基酸之后，與信號肽識別體(SRP)識別并牽引至內質網(wǎng)進行糖基化修飾。通過進化樹分析，發(fā)現(xiàn)C1A-PH-SCH1與致病疫霉菌半胱氨酸蛋白酶家族-木瓜蛋白酶亞家族在進化樹上同源性最高，以及在SMART的蛋白功能結構域預測顯示C1A-PH-SCH1擁有Pept-C1結構域，在保守區(qū)域內也具有木瓜蛋白酶亞家族共有的活性位點Gln-Cys-His-Asn/Asp。因此，可推斷C1A-PH-SCH1屬于木瓜蛋白酶亞家族。