馬爭發(fā),譚維群,余甜甜,崔世煜,廖秋香,張麗杰

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054)

0 引 言

水凝膠是高分子間通過共價鍵、氫鍵或范德華力等作用相互交聯而形成的一種三維網狀材料，能夠在水中溶脹、吸收并保持大量水分而又不溶解于水[1-3]，具有良好的生物相容性、保濕性和易修飾性[4-6]。水凝膠被廣泛應用于生物醫(yī)藥領域，如創(chuàng)傷敷料[7]，組織工程支架[8-9]，藥物緩釋載體[10]等。PVA(聚乙烯醇)由VAc(醋酸乙烯)經聚合醇解而制成的水溶性高分子材料，具有良好的成膜性、力學性能、降解性和安全性，且制備方法簡單重復性好，是合成水凝膠敷料的主要原料之一。但單一PVA合成的水凝膠通常無生物活性，在生物醫(yī)學方面存在缺陷，極大的限制了其推廣應用。通常與其他材料一起制備復合水凝膠以滿足各方面的需求。PMLA(聚蘋果酸)是唯一一種含酯鍵又能快速水解的高分子聚合物，水解產物為蘋果酸單體，可進入三羧酸循環(huán)中被降解。同時其分子結構上含有很水溶性、血液穩(wěn)定性和抑菌性等[11-13]，被廣泛應用于藥物載體等領域，但在生物多化學性能活潑的羧基，這些游離的羧基賦予PMLA良好的修飾性、生物相容性、醫(yī)用敷料中尚未見使用。傷口的愈合是一個緩慢的過程，眾多的外界因素會導致其愈合緩慢，其中細菌感染就最常見的因素。在傷口愈合過程中如果產生感染細菌，就會引起傷口化膿，導致傷口愈合時間延長，嚴重的甚至會引起膿毒血癥，危害生命健康。因此，敷料具有抑菌性是非常有必要的。課題組在實驗中發(fā)現，加入聚蘋果酸的敷料，具有良好的抑菌效果，因此本文通過將PMLA和PVA共混改性，采用凍融法制備出PVA/PMLA復合水凝膠，探究了復合水凝膠的物理性能和生物性能，以期制備出一種可用于預防傷口感染，促進慢性傷口快速愈合的抗菌水凝膠敷料。

1 實驗方法

1.1 實驗試劑和儀器

聚乙烯醇-1799，成都市科隆化學品有限公司；聚蘋果酸(50% in H2O)，上海麥克林生化科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)、胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基，上海源培生物科技股份有限公司；MTT，北京酷來搏科技有限公司；胎牛血清，上海吉泰依科賽生物科技有限公司。

高壓滅菌鍋，上海博訊醫(yī)療器械有限公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific 公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；離心機，美國Scilogex公司；倒置生物顯微(IX71)，日本Olympus公司；鏡酶標儀(Multiskan GO)，美國 Thermo Scientific 公司；恒溫磁力攪拌器，金壇市精達儀器制造有限公司；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；METTLER AE240電子天平，METTLER TOLEOD；掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司(S-4800型)；微機控制生物力學試驗機，長春機械科學研究院有限公司(DNS20型)；傅立葉變換紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司(Spectr μm 100)。

1.2 PMLA/PVA復合水凝膠的制備

準確稱取適量的PVA放入純水中，在70 ℃水浴加熱下溶脹2 h，再以500 r/ min的轉速，90 ℃下攪拌1 h形成均勻的10%PVA溶液。精確稱取PLMA(50%inH2O)溶液，加入超純水，攪拌均勻，制得10wt%PLMA溶液。將PLMA溶液與PVA溶液按一定質量比共混，混合溶液室溫下以500 r/ min的轉速攪拌30 min,再將混合溶液超聲10 min,將混合均勻的溶液倒入培養(yǎng)皿中，在-20 ℃下冷凍20 h，拿出在室溫下解凍4 h，冷凍-解凍循環(huán)3次，制得PMLA/PVA復合水凝膠。

1.3 PMLA/PVA復合水凝膠的性能評價

1.3.1 PMLA/PVA復合水凝膠的紅外光譜檢測

采用傅里葉變換紅外光譜儀對待測干凝膠進行全反射測試。測試范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數為32，分辨率為1 cm-1。

1.3.2 凝膠分數

稱取適量干凝膠M(g)，在50 ℃純水中浸泡24 h濾去水凝膠中未交聯的分子，剩余的凝膠在60 ℃下干燥，稱重記為m(g)。每組3個平行樣品，取平均值。凝膠分數用以下公式計算[14-15]：

(1)

1.3.3 溶脹率測定

將適量水凝膠冷凍干燥后稱重記為m0，將干凝膠浸泡于超純水中，一段時間t后拿出凝膠，用濾紙擦干凝膠表面水分后稱其質量記為mt，每組3個平行樣品，取平均值。按如下公式計算水凝膠t時刻的溶脹度SRt(%)：

(2)

1.3.4 保濕率測定

將水凝膠稱重記為w0，于室溫下靜置一段時間t后稱重記為wt，再將水凝膠烘干至恒重記為w3，每組3個平行樣品，取平均值，水凝膠的t時保濕率SR(%)：

(3)

1.3.5 力學性能測定

參考國標GB/T1701—2001，將水凝膠剪成40 mm×10 mm的長條狀，使用萬能拉力機，在室溫下以50 mm/min的拉伸速度進行試驗，計算拉伸強度(σ)和斷裂伸長率(ε)，計算公式分別如下：

(4)

式中：σ為拉伸強度， MPa；F為最大拉力，N；b為樣條的寬度，mm；h為樣條的厚度， mm。

(5)

式中：ε為斷裂伸長率，%；L為樣條拉伸后的長度， mm；L0為樣品本身長度， mm。

1.3.6 掃描電子顯微鏡分析

PVA/PMLA復合水凝膠真空干燥后表面噴金，用掃描電鏡在10 kV加速電壓下觀察其表面形態(tài)。

1.3.7 抑菌性能評價

采用抑菌圈法評價凝膠的抑菌性能，同時探究了PMLA含量對水凝膠抑菌性能的影響。分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(105～106CUF/mL)均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基表面，將復合水凝膠(直徑D=6 mm)凝膠片置于培養(yǎng)基上，37 ℃孵育12 h，觀察薄片周圍的細菌生長情況。

1.3.8 細胞毒性測定

參照GB/T16886.5—2003，取最佳配比的復合水凝膠，經紫外充分滅菌1 h后完全浸泡于完全培養(yǎng)基中，于37 ℃水浴中浸提24 h得到浸提液。

取培養(yǎng)到第三代的細胞，接種100 μL到96孔板中，每孔1 000個左右的細胞，細胞單層鋪在孔底，加入100 μL水凝膠浸提液或新鮮培養(yǎng)基。設置空白、陽性對照組、陰性對照組和實驗組，分組如下表1。再繼續(xù)培養(yǎng)72 h天，每24 h取一個96板，每孔用20 μL MTT 溶液處理(5 mg/mL)，然后在37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)后，小心吸取孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，酶標儀測在490nm處測定并記錄OD值，測定前先震板10 s。

表1 細胞毒性實驗分組Table 1 Grouping of cytotoxicity experiments

細胞的毒性情況通過計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR，%)來判定，計算：

(6)

材料毒性分級如下表2所示，材料毒性分級0或1級為合格，2級需結合細胞形態(tài)綜合評價分析，3～5級為不合格[16-17]。

表2 材料毒性評分對照表Table 2 Comparison table of material toxicity scores

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

PVA、PMLA和PVA/PMLA水凝膠的FT-IR譜圖如圖1所示。3 650～3 200 cm-1為O-H的伸縮吸收，O-H締合和氫鍵形成均會會使吸收峰向低波數偏移，PMLA(3 237 cm-1)和PVA(3 246 cm-1)均有較強較寬吸收，而且峰型較寬，說明締合程度較大。當兩者混合后吸收峰發(fā)生左移(3 308 cm-1)，且峰寬變窄，說明締合程度減少。1 850～1 630 cm-1為C=O的伸縮振動區(qū)，其中酮、酸的區(qū)域集中在1 725～1 700 cm-1，在PMLA的紅外圖譜中可以明顯看到1 725 cm-1的吸收峰，當兩者混合后吸收峰發(fā)生右移(1 714 cm-1)，當形成氫鍵時，吸收位置向低波數位移。COO-是一個多電子的共軛體系，兩個C=O振動偶合，C-O在兩個地方出現強吸收，分別是反對稱伸縮振動在1 610～1 560 cm-1，對稱伸縮振動在1 440～1 360 cm-1，PMLA的紅外圖譜中在1 591 cm-1和1 420 cm-1處有強吸收峰，當兩者混合后1 591 cm-1的吸收峰幾乎消失，COO-的反對稱伸縮振動受到明顯抑制，說明產生了氫鍵。實驗結果表明PVA與PMLA混合后，兩者形成了較強氫鍵作用。

圖1 PVA、PMLA和PVA/PMLA水凝膠的FT-IR譜圖Fig 1 FT-IR spectra of PVA, PMLA and PVA/PMLA hydrogels

2.2 凝膠分數

水凝膠是高分子交聯而成的一種三維網狀結構，凝膠分數表明了網絡形成的程度以及網絡在水中溶解的穩(wěn)定性。不同質量比復合水凝膠的凝膠分數如圖2所示，可以看出，復合水凝膠的凝膠分數在50%～82%之間，有著良好的穩(wěn)定性。當PVA含量7%，PMLA含量0.25%時，復合水凝膠有著最高的凝膠分數(81.83±0.01%)；當PMLA含量一定時，凝膠分數隨著PVA含量的增加而增加；但當PVA含量一定時，凝膠分數隨著PMLA含量的增加而降低，這與冷凍解凍法制備PVA水凝膠的原理有關[18-20]，PMLA分子上含有大量游離的羧基(-COOH)，與PVA分子上的羥基(-OH)形成氫鍵，導致復合水凝膠的結晶度降低，凝膠分數減小。

圖2 不同質量比復合水凝膠的凝膠分數Fig 2 Gel fraction of composite hydrogels with different mass ratios

2.3 溶脹率

水凝膠作為一種理想的創(chuàng)面敷料材料，其吸收和保存液體的能力是評價其效果的一個重要方面。水凝膠的溶脹率是評價凝膠吸收液體能力的重要指標。不同比例的復合水凝膠的溶脹性能如下圖3所示。由圖可知，PVA/PMLA復合水凝膠的溶脹率在500%～1 000%，具有良好的吸水性。溶脹12 h后，水凝膠的吸水速率變?yōu)榫徛?4 h后基本達到溶脹平衡狀態(tài)。從圖中可以看出敷料的溶脹率隨著PVA濃度的增加而降低，在同一PVA濃度下隨著PMLA濃度的增加而減少，這是因為PVA濃度增大復合水凝膠交聯程度提高；在同一PVA濃度下，隨著PMLA濃度的增大，PMLA和PVA有更多的氫鍵形成，交聯度提高從而使溶脹率下降。當PVA為5%，PMLA為0%的水凝膠的溶脹率最高，可高達1 047%；溶脹率最低的是PVA為7%、PMLA為1%時的復合水凝膠，為548%。

圖3 不同比例的復合水凝膠的溶脹時間曲線(圖a為PVA5wt%，圖b為PVA6wt%，圖c為PVA7wt%)Fig 3 Swelling time curves for different ratios of composite hydrogels (Fig a for PVA 5 wt%, Fig b for PVA 6 wt% and Fig c for PVA 7 wt%)

2.4 保濕率

對于滲出傷口而言，敷料在吸收傷口滲液與蒸發(fā)的水分之間取得平衡是敷料應用的重要性能，保持傷口的濕潤能為細胞再生和運動提供合適的條件，維持酶和表皮生長因子的生物活性，從而加速傷口愈[21]。圖4顯示了PVA/PMLA復合水凝膠的保濕能力與時間的關系。從圖中可知，隨著時間的增加，保濕率在逐漸下降。12 h后，復合水凝膠的保濕率在44%～70%，具有較好的保濕效果；24 h后，復合水凝膠的保濕率在6%～45%。從圖4中還可明顯地看出PVA水凝膠的保濕率明顯低于PVA/PMLA復合水凝膠，隨著PMLA濃度增加，保濕率增加。PVA為7%時，PMLA為1%的復合水凝膠的保濕能力最佳，保濕率為45.4%；PMLA為0%的水凝膠濕僅。這可能是因為聚蘋果酸上具有很多游離的羧基可與水分子作用形成氫鍵，增強了水凝膠對水分子的吸附力，這有利于為皮膚提供一個濕潤的環(huán)境。

圖4 不同比例的復合水凝膠的保濕率-時間曲線(左圖a PVA 7wt%,PMLA分別為0wt%、0.25wt%、0.5wt%和1.0%，圖b為PMLA0wt%，PVA分別為5wt%、6wt%和7wt%)Fig 4 Humidity-time curves for different ratios of composite hydrogels (left panela PVA7 wt%, PMLA 0 wt%, 0.25 wt%, 0.5 wt% and 1.0 wt% respectively and panel b PMLA 0 wt%, PVA5 wt%, 6 wt% and 7 wt% respectively)

2.5 力學性能分析結果

不同配比的PVA/PMLA復合水凝膠通過萬能力學試驗機測得其拉伸力學性能如圖5所示。從圖中可以看出，PVA水凝膠的拉伸強度分別為0.025、0.038和0.048 MPa，裂伸長率在206.71%、182.23%、209.05%；PVA/PMLA復合水凝膠的拉伸強度在0.018～0.048 MPa，斷裂伸長率在186.51%～235.32%之間。隨著PVA的增加，拉伸強度增加顯著，斷裂伸長率沒有顯著變化；隨著PMLA的增加，復合水凝膠的拉伸強度略有降低，斷裂伸長率明顯增大，說明在PVA/PMLA水凝膠中，PVA鏈對拉伸強度起主導作用，PMLA對拉伸強度影響較小，但可以增加復合膠的斷裂伸長率，這是因為PMLA和PVA之間形成了氫鍵，使得PVA鏈的結晶度減低，拉伸強度降低；鏈段變長，同時PMLA作為非結晶鏈，增強了水凝膠的分子鏈長，其伸長能力有效地提高，斷裂伸長率變化明顯。

圖5 復合水凝膠的力學性能(圖a為斷裂伸長率，圖b為拉伸強度)Fig 5 Mechanical properties of the composite hydrogel (Fig a shows elongation at break, Fig b shows tensile strength)

2.6 掃描電子顯微鏡分析

由圖6的電鏡結果可以看出，PVA(5%)水凝膠和(5%/0.25%)合水凝膠具大量的三維網絡結構。PVA水凝膠的孔隙率為69.6%，平均孔徑397 μm；PVA/PMLA復合水凝膠的孔隙率為65.0%，平均孔徑為515 μm，PVA/PMLA復合水凝膠的孔徑明顯大于PVA水凝膠，和紅外吸收光譜分析的結果一致。即形成PVA/PMLA的復合水凝膠中，PVA分子間氫鍵結合減少，凝膠分率下降，PMLA和PVA之間形成了氫鍵，使得PVA分子間結合得更疏松，孔徑增大。多孔的三維網絡結構不僅有利于營養(yǎng)物質、氧氣及水分在細胞之間進行傳遞，還有利于將細胞代謝的物質及時移除，從而促進細胞遷移增殖。

圖6 水凝膠電鏡圖(A為PVA，B為PVA/PMLA)Fig 6 Hydrogel electron micrographs (A for PVA, B for PVA/PMLA)

2.7 抑菌實驗

將不同配比的復合水凝膠對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)進行抑菌實驗，抑菌效果如圖7所示。由圖7可知，PVA水凝膠無抑菌性，PVA/PMLA復合水凝膠具有較好的抑菌性，PMLA的含量越高復合水凝膠的抑菌效果越好。當PMLA含量為1wt%時，復合水凝膠的抑菌效果較佳，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為14.8 mm和16.5 mm。

圖7 不同配比復合水凝膠抑菌效果(圖(a)為大腸桿菌，圖(b)為金黃葡萄菌)Fig 7 Bacterial inhibition effect of different ratios of composite hydrogels (Fig (a) for E. coli, Fig (b) for S. aureus)

2.8 細胞毒性

以溶脹和保濕性能最佳的復合水凝膠制備浸提液，采用MTT法測得復合水凝膠3d的增殖情況與細胞毒性等級表3所示。由表3可知，實驗組和對照組的1-3d的細胞相對增殖率都在80%～90%之間，細胞毒性等級都在1級，但復合水凝膠的相對增值率高于市售敷料，依據GB/T—16886.5—2003醫(yī)療器械生物學評價標準，浸提液對細胞均無顯著影響。研究結果表明，復合水凝膠和市售敷料沒有明顯的細胞毒性，生物相容性優(yōu)于市售敷料。

表3 復合水凝膠的細胞毒性情況Table 3 Cytotoxicity profile of composite hydrogels

3 結 論

以PVA和PMLA為材料，通過物理方法制得表面光滑的復合水凝膠，考察了不同配比的PVA/PMLA復合水凝膠在吸水性、保濕性和力學性能等區(qū)別，并對復合水凝膠的細胞毒性進行了體外評價。

(1)通過紅外光譜和掃描電鏡分析，結果表明PVA/PMLA復合水凝膠中PMLA能與PVA以氫鍵結合，有大量互通的孔隙結構，隨著PMLA的加入，PVA分子間的氫鍵減少，復合水凝膠的空隙率減小、孔徑增大。

(2)通過對PVA/PMLA復合水凝膠的物理性能進行表征，結果表明PVA/PMLA復合水凝膠具有良好的保濕性能和力學性能，PMLA的加入明顯提高了復合水凝膠的保濕能力。

(3)抑菌實驗結果顯示PVA水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌無抑菌活性；PVA/PMLA復合水凝膠對兩種菌都具有良好的抑制效果，抑菌活性隨著PMLA含量的增加而增加。

(4)體外細胞毒性實驗結果表明PVA/PMLA復合水凝膠無細胞毒性，生物相容性優(yōu)于市售敷料，有望作為一種理想的醫(yī)用水凝膠敷料，用于慢性傷口的護理。