徐東蕊,王小龍,馬文超,劉同祥,董元寶,尹麗娟

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊,261000;2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 急診部,山東 濰坊,261000;3.山東省濰坊市坊子區(qū)人民醫(yī)院 心內(nèi)科,山東 濰坊,261000;4.山東省濰坊市呼吸病醫(yī)院 消化內(nèi)科,山東 濰坊,261000)

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)為缺血性心肌病的急性表現(xiàn)，盡早識(shí)別及減輕其危險(xiǎn)因素，及時(shí)應(yīng)用藥物及侵入性干預(yù)治療，對于緩解ACS患者癥狀及改善其臨床預(yù)后具有重要價(jià)值[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)術(shù)對于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病療效顯著。研究[2]表明，冠狀動(dòng)脈支架植入導(dǎo)致血管內(nèi)皮機(jī)械性損傷觸發(fā)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)貫穿支架內(nèi)再狹窄(ISR)全過程，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此，為臨床探尋新的治療靶點(diǎn)，尋找提示預(yù)后的相關(guān)因子，對預(yù)防ACS患者PCI術(shù)后ISR具有重要意義。PCI術(shù)后炎癥反應(yīng)靶點(diǎn)眾多，關(guān)于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體的研究也越來越多，但NLRP3與ISR及其嚴(yán)重程度有無相關(guān)性的相關(guān)研究較少。本研究比較PCI前后NLRP3表達(dá)水平差異，分析ISR及其嚴(yán)重程度與NLRP3表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2020年3月—2021年2月行PCI術(shù)的150例患者為研究對象，根據(jù)ISR診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為ISR組(n=22)與對照組(n=128)。2組患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

表1 2組患者治療前基線資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn):① 初次支架植入者;② 支架植入后1年內(nèi)行規(guī)律雙聯(lián)抗血小板聚集及調(diào)脂治療者。ISR診斷標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)查冠狀動(dòng)脈造影顯示，支架內(nèi)及其邊緣5 mm范圍內(nèi)狹窄程度≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn):① 重度肝功能不全(Child-Pugh C級(jí))者;② 惡性腫瘤患者;③ 嚴(yán)重感染性疾病患者;④ 重度腎功能不全[估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)<30 mL/(min·1.73 m2)]者;⑤甲狀腺功能異常者;⑥ 自身免疫性疾病患者;⑦ 嚴(yán)重出血性疾病或凝血功能障礙者;⑧ 隨訪資料不全者;⑨ 研究期間多次行PCI者。

1.2 方法

150例患者于術(shù)前、術(shù)后24 h進(jìn)行NLRP3相關(guān)檢測,1年后復(fù)查冠狀動(dòng)脈造影。冠狀動(dòng)脈的狹窄程度由2名心血管專業(yè)介入醫(yī)師共同判讀，二者存在分歧時(shí)請第3名心血管專業(yè)介入醫(yī)師協(xié)助判讀。對冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度的評估采用Gensini評分系統(tǒng)[3],狹窄程度1%～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為4分,>75%～90%為8分,>90%～<100%為16分,100%(閉塞)為32分。每支冠狀動(dòng)脈血管均以最狹窄處參與評分，各血管評分相加為最終評分。1年后復(fù)查時(shí)原支架植入血管狹窄程度1%～25%設(shè)為輕度狹窄組,>25%～50%為中度狹窄組,>50%～75%為重度狹窄組,>75%～100%為極重狹窄組[4]。

經(jīng)患者肱靜脈抽取靜脈血6 mL置于抗凝管中，加入等量平衡鹽溶液(Hanks)并將其混勻稀釋，之后沿管壁緩慢置于離心管中，離心管中提前加入淋巴細(xì)胞分離液，在半徑為13.5 cm的離心機(jī)中以1 500轉(zhuǎn)/min的速度離心10 min,輕取界面白色霧狀細(xì)胞層,Hanks液洗2次后，在半徑為13.5 cm的離心機(jī)中以1 500轉(zhuǎn)/min的速度離心5 min。將含10%胎牛血清的洛斯維·帕克紀(jì)念研究所(RPMI)研制的1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞接種至6孔板中，在孵箱中以37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)48 h后[4],用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗后分離出非黏附細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞。

NLRP3的定量分析采用免疫印跡法。將1.5 mL的樣本置于離心管中，保持其無菌并在冰上操作，配制細(xì)胞裂解液，以模型450型酶聯(lián)免疫儀(美國BIO-RAD公司)測波長為492 nm的吸收值定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

PCI術(shù)前及術(shù)后24 h,ISR組NLRP3表達(dá)水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);1年后復(fù)查時(shí),ISR組NLRP3表達(dá)水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ISR組PCI術(shù)后24 h與1年后復(fù)查時(shí)NLRP3水平與PCI術(shù)前比較均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對照組PCI術(shù)后24 h較PCI術(shù)前NLRP3水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。1年后復(fù)查時(shí),4組間的NLRP3水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。1年后復(fù)查時(shí)NLRP3水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度之間存在正相關(guān)關(guān)系 (r=0.862,P=0.001),見圖1。

表2 2組患者NLRP3表達(dá)水平比較 pg/mL

表3 各組患者1年后復(fù)查時(shí)NLRP3水平比較 pg/mL

3 討 論

隨著冠心病發(fā)病率的升高,PCI目前被廣泛應(yīng)用，但動(dòng)脈粥樣硬化的再發(fā)導(dǎo)致ISR發(fā)生，其相關(guān)機(jī)制與解決方案目前尚未徹底明確。炎癥作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的驅(qū)動(dòng)過程之一，NLRP3及其下游炎癥因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)等可作為治療冠心病潛在靶點(diǎn)[5]。NLRP3炎癥小體為由傳感器蛋白定義的炎癥體，研究[6-7]表明其在冠心病患者主動(dòng)脈中存在過度表達(dá),NLRP3炎癥小體因其在機(jī)體免疫中介導(dǎo)多信號(hào)的途徑逐漸被重視，除介導(dǎo)天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶-1(caspase-1)的激活以外，還可調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-18的分泌等，而IL-1β可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,IL-18與冠心病的心血管死亡相關(guān)[8-9]。IL-1β作為NLRP3的激活指標(biāo)，研究[10-11]表明，IL-1β表達(dá)水平與Gensini評分存在正相關(guān)關(guān)系，且多支冠狀動(dòng)脈病變患者較單支冠狀動(dòng)脈病變患者中IL-1β表達(dá)水平明顯上升。

本研究中,2組患者PCI術(shù)后24 h NLRP3水平均高于本組PCI術(shù)前，可能與PCI術(shù)后血管內(nèi)皮損傷，平滑肌細(xì)胞遷移、增殖，刺激炎癥因子的釋放有關(guān)。此外,1年后復(fù)查時(shí),ISR組NLRP3水平較PCI術(shù)前顯著升高，且在一定范圍內(nèi)隨著ISR嚴(yán)重程度的升高可逐漸增高。NLRP3作為一種多蛋白先天免疫復(fù)合物，可通過抑制其激活，保護(hù)心肌成纖維細(xì)胞免受缺氧損傷[12]。慢性炎癥是動(dòng)脈壁粥樣硬化的“危險(xiǎn)信號(hào)”，而NLRP3是由于膽固醇晶體缺氧激活，導(dǎo)致心肌缺血再灌注期間增加梗死面積的重要因素。血糖變異性可能通過NLRP3小體影響血管內(nèi)膜的增生及斑塊穩(wěn)定性[13-14]。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，在接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的患者中,NLRP3表達(dá)水平可能與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程度高度相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，隨支架內(nèi)狹窄程度增高,NLRP3表達(dá)水平亦有升高傾向。本研究為一項(xiàng)前瞻性研究，既往此類研究大部分為回顧性研究，資料信息的穩(wěn)定性、及時(shí)效性均有受損，而本研究立足當(dāng)前，信息的真實(shí)性及信息來源將更加穩(wěn)定。

近幾年，國內(nèi)外對NLRP3炎癥小體的研究越來越多，但關(guān)于其與冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后ISR程度有無相關(guān)性的研究報(bào)道較少。通過檢測冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后NLRP3炎癥小體的釋放，分析其與冠狀動(dòng)脈ISR的相關(guān)性，對臨床預(yù)測ISR具有一定的參考價(jià)值，從而利于提前進(jìn)行治療干預(yù)，進(jìn)一步降低ISR的概率，提高患者生活質(zhì)量。但本研究仍存在一定局限，例如入選病例數(shù)相對較少，隨訪周期較短，信息偏倚及混雜偏倚對結(jié)果造成的影響不能排除，從樣本結(jié)果來看,NLRP3表達(dá)水平隨PCI術(shù)后冠脈狹窄程度的增加而逐漸升高，但仍不能確定代表總體人群的表達(dá)，以后還需更多的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)加以驗(yàn)證。

綜上所述，冠心病患者存在NLRP3高表達(dá)，且一定范圍內(nèi)NLRP3表達(dá)水平與PCI后ISR嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。