陳 嫻，李詠梅，曾 艷，伍善東，劉冬華

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

油菜是我國(guó)重要的油料作物，是湖南省僅次于水稻生產(chǎn)面積的第二大農(nóng)作物，種植面積和菜籽產(chǎn)量均位居全國(guó)前列[1-2]。油菜的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，病害種類較多，有菌核病、病毒病、白銹病、黑斑病等[3-4]。其中，危害最嚴(yán)重的是油菜菌核病，該病在我國(guó)各油菜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。油菜菌核病是由核盤菌感染引發(fā)的一類土傳病害，其危害導(dǎo)致的減產(chǎn)量約占總病害減產(chǎn)量的80%，嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。長(zhǎng)期以來(lái)，油菜菌核病的防治主要是噴施化學(xué)殺菌劑，如苯并咪唑類殺菌劑。隨著藥劑的常年使用，殘留的藥劑會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染；同時(shí)，部分核盤菌對(duì)這類化學(xué)藥劑產(chǎn)生了明顯的抗藥性，從而導(dǎo)致藥劑的防治效果越來(lái)越差[6-7]。隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)保、食品安全的重視，利用生物法防治農(nóng)作物病蟲害已成為目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

植物內(nèi)生菌是一類能夠定殖在健康植物組織內(nèi)部而對(duì)宿主植物不造成明顯病害癥狀的一類微生物。內(nèi)生菌從植物體獲取生存空間、營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也會(huì)給植物帶來(lái)一些生長(zhǎng)上的優(yōu)勢(shì)，如促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗病能力等[8]。隨著綠色農(nóng)業(yè)的興起，我國(guó)科學(xué)界對(duì)植物內(nèi)生菌的研究和應(yīng)用逐漸增加[9]。已有研究表明，枯草芽孢桿菌BY-2[10]、多粘類芽孢桿菌SF4[11]、芽孢桿菌Y171004、Y177002[12]等油菜內(nèi)生菌對(duì)核盤菌有抑制效果。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前可用來(lái)防治油菜菌核病的內(nèi)生拮抗菌種類仍然較少，且未見有進(jìn)入田間實(shí)際應(yīng)用的微生物菌劑的報(bào)道。為了尋求效果優(yōu)良的油菜菌核病生防菌株，研究從油菜植株中分離得到1 株高效的拮抗菌1-4，并進(jìn)行了菌種鑒定，初步探討了該菌對(duì)菌核病的防治效果，豐富了油菜菌核病內(nèi)生拮抗菌菌種資源，為進(jìn)一步開展田間試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株油菜內(nèi)生菌：由實(shí)驗(yàn)室從健壯油菜根、莖的韌皮部分離得到。核盤菌ACCC 37701（源自油菜）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基（1）PDA 加富培養(yǎng)基：土豆（煮汁）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.0 g/L，牛肉膏2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，瓊脂18 g/L，自然pH 值。（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 值 7.0。加入18 g/L的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 油菜內(nèi)生菌的分離純化采集健壯的油菜植株，用清水將根部泥沙洗干凈，削取白色健壯無(wú)斑的根須和韌皮部。用75%的酒精浸泡消毒12 min，無(wú)菌水浸泡洗滌6 次；再用0.2%的HgCl2浸泡消毒18 min，無(wú)菌水浸泡洗滌9 次，第9 次的浸泡洗滌水留下作為對(duì)照。將油菜根須和韌皮部放入無(wú)菌碾缽中加入適量無(wú)菌水碾磨成漿，取漿液進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-5）。從各稀釋梯度液中吸取200 μL 涂布到PDA 加富培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，挑取不同形態(tài)的單個(gè)內(nèi)生菌落，在平板上采取四分區(qū)劃線法純化3～4 次，將純化后單菌落利用試管斜面低溫保存待用。

1.2.2 核盤病菌拮抗菌株的篩選（1）平板對(duì)峙法初篩：將直徑為1 cm 的油菜核盤菌接種到PDA 加富平板（直徑9 cm）的中心，將所有分離的內(nèi)生菌接種到距離平板中心2.5 cm 處，以不接種內(nèi)生菌的平板為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。待對(duì)照組核盤菌長(zhǎng)滿平板時(shí)，測(cè)量各內(nèi)生菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑，選出具有拮抗效果的內(nèi)生菌進(jìn)行復(fù)篩。（2）牛津杯法復(fù)篩：將直徑為1 cm 的油菜核盤菌接種到PDA 加富平板（直徑9 cm）的中心，在距核盤菌菌絲擴(kuò)展的外緣呈等邊三角形放置3 個(gè)牛津杯，再將培養(yǎng)5 d 的拮抗菌菌液加入至牛津杯中，每處理重復(fù)3 次。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察抑菌圈并用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄其直徑。

1.2.3 拮抗菌1-4的菌種鑒定（1）形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定：將效果最佳的拮抗菌1-4 接種在牛肉膏蛋白胨平板上，培養(yǎng)3 d 后觀察其菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中操作說(shuō)明，對(duì)拮抗細(xì)菌1-4 進(jìn)行生理生化鑒定。（2）16S rDNA 序列分析：用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株1-4的基因組DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′）進(jìn)行16S rDNA 序列的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；95℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用膠回收試劑盒純化回收，送上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 比對(duì)，利用Mega 5.0 軟件中Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 拮抗菌1-4對(duì)油菜菌核病的盆栽防治效果接種拮抗菌1-4 到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)72 h，稀釋發(fā)酵液活菌數(shù)至1.0×108CFU/mL 制成菌懸液，待用。將菌懸液以4℃，8 000 r/min 離心15 min，取上清液并用0.22 μm 的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，制成無(wú)菌發(fā)酵液待用。該試驗(yàn)所用油菜品種為甘藍(lán)型油菜湘油15，在每個(gè)小號(hào)培養(yǎng)盆中種植一株，待油菜長(zhǎng)至5～8片葉時(shí)，分別將菌株1-4 的菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液均勻噴施于葉片表面，30 min 后接種直徑5 mm 的油菜菌核病菌菌絲塊，置于25℃左右人工氣候箱中保濕培養(yǎng)（光照/黑暗=16 h/8 h），以噴施無(wú)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基處理的葉片為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)5 株，2 片葉/株，1 個(gè)菌絲塊/片葉，重復(fù)3 批次。當(dāng)對(duì)照葉片上出現(xiàn)病斑時(shí)以及出現(xiàn)病斑2 d 后分別統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。記錄各處理發(fā)病植株數(shù)及發(fā)病嚴(yán)重度，根據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)表示無(wú)病；1 級(jí)表示病斑面積占全葉10%以下；2 級(jí)表示病斑面積占全葉10%～30%；3級(jí)表示病斑面積占全葉31%～50%；4 級(jí)表示病斑面積占全葉51%以上[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 軟件計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行繪圖；利用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差（ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜菌核病內(nèi)生拮抗菌的篩選

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣等特征對(duì)油菜內(nèi)生菌比較去冗余后，利用PDA 加富培養(yǎng)基共分離出72 株內(nèi)生菌。用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩后，發(fā)現(xiàn)有6 株菌株對(duì)核盤菌有抑制作用。牛津杯法復(fù)篩結(jié)果（圖1）表明，菌株1-4、7-3 抑菌圈直徑較大，其中菌株1-4 對(duì)油菜核盤菌的抑制能力最強(qiáng)。采用連續(xù)傳代法對(duì)菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2 所示，菌株1-4 發(fā)酵液的抑菌活性在傳代過(guò)程中無(wú)顯著改變，說(shuō)明其遺傳穩(wěn)定性好。因此，選擇該菌株進(jìn)行下一步研究。

圖1 篩選出的拮抗內(nèi)生菌對(duì)核盤菌的抑菌效果

圖2 菌株1-4 抑菌能力的遺傳穩(wěn)定性

2.2 菌株1-4 的菌種鑒定

菌株1-4 在牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌落呈圓形，表面粗糙，邊緣不整齊，無(wú)色素產(chǎn)生；在油鏡下，菌體為中等長(zhǎng)度桿狀，單生，產(chǎn)芽孢（圖3），革蘭氏染色呈陽(yáng)性。菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，這些生理生化特性與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中對(duì)地衣芽孢桿菌的描述一致。

圖3 菌株1-4 的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征（×1 000 倍）

表1 菌株1-4 的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

PCR 擴(kuò)增獲得菌株1-4 的 16S rDNA 序列長(zhǎng)度為 1 430 bp（Genbank 登錄號(hào)：MZ520363），將其與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，菌株與Bacillus licheniformisDSM 13 的相似性較高，基于其16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4 所示。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的結(jié)果，可確定菌株1-4 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖4 基于菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株1-4 對(duì)油菜菌核病的盆栽防治效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，試驗(yàn)48 h 時(shí)，菌株1-4 的菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液處理組的油菜菌核病病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照組，防治效果分別為84.84%、76.07%，說(shuō)明菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液處理對(duì)油菜菌核病均有顯著抑制效果。試驗(yàn)96 h 時(shí)，各處理組油菜的病情指數(shù)不斷增大，菌懸液、無(wú)菌發(fā)酵液處理的防治效果分別為78.22%、69.95%，比之前有所降低，但仍具有較好的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，菌懸液處理的防治效果顯著高于同時(shí)期無(wú)菌發(fā)酵液處理，說(shuō)明活菌體才是防治效果發(fā)揮的根本原因。

表2 菌株1-4 對(duì)油菜菌核病的盆栽防治效果

3 結(jié) 論

該研究從健壯油菜植株內(nèi)分離得到72 株內(nèi)生菌，通過(guò)平板對(duì)峙法和牛津杯法篩選到6 株對(duì)油菜菌核病致病菌核盤菌具有拮抗活性的內(nèi)生菌。其中，菌株1-4對(duì)核盤菌的抑制作用非常顯著，且經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，其抑菌特性能夠穩(wěn)定遺傳。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析，將菌株1-4 鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株的菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液均對(duì)油菜菌核病有較好的防治效果，且菌懸液處理的防效優(yōu)于無(wú)菌發(fā)酵液。

4 討 論

目前，科技工作者主要從農(nóng)作物根際土壤微生物和作物內(nèi)生菌中篩選病蟲害生防菌。相對(duì)于根際土壤微生物，作物內(nèi)生菌是一類與植物互惠共生的微生物，可以提高作物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力，生物安全性高。地衣芽孢桿菌是一種廣泛應(yīng)用的生防菌，對(duì)稻瘟病菌、輪紋病菌、青霉病菌、枯萎病菌等具有一定的防效。據(jù)統(tǒng)計(jì)（截至2020 年9 月），地衣芽孢桿菌在7 051 種登記的微生物菌肥產(chǎn)品中的應(yīng)用頻次為1 517 次，應(yīng)用率為21.51%，應(yīng)用非常廣泛[14]。該類生防菌的安全性高、生長(zhǎng)快、抗逆能力強(qiáng)，故該試驗(yàn)篩選獲得的拮抗菌1-4 具有良好的應(yīng)用前景。

拮抗菌1-4 的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病也有顯著的防治效果，說(shuō)明其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了某些抑制核盤菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。孫啟利等[15]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌W10 產(chǎn)生的抗菌蛋白可顯著抑制病菌的生長(zhǎng)，而菌株1-4 是否也可產(chǎn)生類似的抗菌蛋白，有待進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)中，菌懸液處理的防治效果顯著優(yōu)于同時(shí)期無(wú)菌發(fā)酵液處理，其原因可能是菌懸液中的活菌體能夠在油菜上定殖，循環(huán)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)[10]。