陳 嫻,李詠梅,曾 艷,伍善東,劉冬華
(湖南省微生物研究院,湖南 長(zhǎng)沙 410009)
油菜是我國(guó)重要的油料作物,是湖南省僅次于水稻生產(chǎn)面積的第二大農(nóng)作物,種植面積和菜籽產(chǎn)量均位居全國(guó)前列[1-2]。油菜的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),病害種類(lèi)較多,有菌核病、病毒病、白銹病、黑斑病等[3-4]。其中,危害最嚴(yán)重的是油菜菌核病,該病在我國(guó)各油菜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。油菜菌核病是由核盤(pán)菌感染引發(fā)的一類(lèi)土傳病害,其危害導(dǎo)致的減產(chǎn)量約占總病害減產(chǎn)量的80%,嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。長(zhǎng)期以來(lái),油菜菌核病的防治主要是噴施化學(xué)殺菌劑,如苯并咪唑類(lèi)殺菌劑。隨著藥劑的常年使用,殘留的藥劑會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染;同時(shí),部分核盤(pán)菌對(duì)這類(lèi)化學(xué)藥劑產(chǎn)生了明顯的抗藥性,從而導(dǎo)致藥劑的防治效果越來(lái)越差[6-7]。隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)保、食品安全的重視,利用生物法防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害已成為目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。
植物內(nèi)生菌是一類(lèi)能夠定殖在健康植物組織內(nèi)部而對(duì)宿主植物不造成明顯病害癥狀的一類(lèi)微生物。內(nèi)生菌從植物體獲取生存空間、營(yíng)養(yǎng)的同時(shí),也會(huì)給植物帶來(lái)一些生長(zhǎng)上的優(yōu)勢(shì),如促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗病能力等[8]。隨著綠色農(nóng)業(yè)的興起,我國(guó)科學(xué)界對(duì)植物內(nèi)生菌的研究和應(yīng)用逐漸增加[9]。已有研究表明,枯草芽孢桿菌BY-2[10]、多粘類(lèi)芽孢桿菌SF4[11]、芽孢桿菌Y171004、Y177002[12]等油菜內(nèi)生菌對(duì)核盤(pán)菌有抑制效果。根據(jù)文獻(xiàn)檢索,目前可用來(lái)防治油菜菌核病的內(nèi)生拮抗菌種類(lèi)仍然較少,且未見(jiàn)有進(jìn)入田間實(shí)際應(yīng)用的微生物菌劑的報(bào)道。為了尋求效果優(yōu)良的油菜菌核病生防菌株,研究從油菜植株中分離得到1 株高效的拮抗菌1-4,并進(jìn)行了菌種鑒定,初步探討了該菌對(duì)菌核病的防治效果,豐富了油菜菌核病內(nèi)生拮抗菌菌種資源,為進(jìn)一步開(kāi)展田間試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。
1.1.1 試驗(yàn)菌株油菜內(nèi)生菌:由實(shí)驗(yàn)室從健壯油菜根、莖的韌皮部分離得到。核盤(pán)菌ACCC 37701(源自油菜)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所提供。
1.1.2 培養(yǎng)基(1)PDA 加富培養(yǎng)基:土豆(煮汁)200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨2.0 g/L,牛肉膏2.0 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,磷酸二氫鉀1.0 g/L,瓊脂18 g/L,自然pH 值。(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,pH 值 7.0。加入18 g/L的瓊脂即為固體培養(yǎng)基。
1.2.1 油菜內(nèi)生菌的分離純化采集健壯的油菜植株,用清水將根部泥沙洗干凈,削取白色健壯無(wú)斑的根須和韌皮部。用75%的酒精浸泡消毒12 min,無(wú)菌水浸泡洗滌6 次;再用0.2%的HgCl2浸泡消毒18 min,無(wú)菌水浸泡洗滌9 次,第9 次的浸泡洗滌水留下作為對(duì)照。將油菜根須和韌皮部放入無(wú)菌碾缽中加入適量無(wú)菌水碾磨成漿,取漿液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-1~10-5)。從各稀釋梯度液中吸取200 μL 涂布到PDA 加富培養(yǎng)基平板上,28℃恒溫培養(yǎng)5 d 后,挑取不同形態(tài)的單個(gè)內(nèi)生菌落,在平板上采取四分區(qū)劃線法純化3~4 次,將純化后單菌落利用試管斜面低溫保存待用。
1.2.2 核盤(pán)病菌拮抗菌株的篩選(1)平板對(duì)峙法初篩:將直徑為1 cm 的油菜核盤(pán)菌接種到PDA 加富平板(直徑9 cm)的中心,將所有分離的內(nèi)生菌接種到距離平板中心2.5 cm 處,以不接種內(nèi)生菌的平板為對(duì)照,28℃恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)3 次。待對(duì)照組核盤(pán)菌長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí),測(cè)量各內(nèi)生菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑,選出具有拮抗效果的內(nèi)生菌進(jìn)行復(fù)篩。(2)牛津杯法復(fù)篩:將直徑為1 cm 的油菜核盤(pán)菌接種到PDA 加富平板(直徑9 cm)的中心,在距核盤(pán)菌菌絲擴(kuò)展的外緣呈等邊三角形放置3 個(gè)牛津杯,再將培養(yǎng)5 d 的拮抗菌菌液加入至牛津杯中,每處理重復(fù)3 次。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)3 d,觀察抑菌圈并用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄其直徑。
1.2.3 拮抗菌1-4的菌種鑒定(1)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定:將效果最佳的拮抗菌1-4 接種在牛肉膏蛋白胨平板上,培養(yǎng)3 d 后觀察其菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中操作說(shuō)明,對(duì)拮抗細(xì)菌1-4 進(jìn)行生理生化鑒定。(2)16S rDNA 序列分析:用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取菌株1-4的基因組DNA,采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)進(jìn)行16S rDNA 序列的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min;95℃ 45 s,56℃ 45 s,72℃ 90 s,30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃終止。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,采用膠回收試劑盒純化回收,送上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 比對(duì),利用Mega 5.0 軟件中Neighbor-joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
1.2.4 拮抗菌1-4對(duì)油菜菌核病的盆栽防治效果接種拮抗菌1-4 到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)72 h,稀釋發(fā)酵液活菌數(shù)至1.0×108CFU/mL 制成菌懸液,待用。將菌懸液以4℃,8 000 r/min 離心15 min,取上清液并用0.22 μm 的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾,制成無(wú)菌發(fā)酵液待用。該試驗(yàn)所用油菜品種為甘藍(lán)型油菜湘油15,在每個(gè)小號(hào)培養(yǎng)盆中種植一株,待油菜長(zhǎng)至5~8片葉時(shí),分別將菌株1-4 的菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液均勻噴施于葉片表面,30 min 后接種直徑5 mm 的油菜菌核病菌菌絲塊,置于25℃左右人工氣候箱中保濕培養(yǎng)(光照/黑暗=16 h/8 h),以噴施無(wú)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基處理的葉片為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)5 株,2 片葉/株,1 個(gè)菌絲塊/片葉,重復(fù)3 批次。當(dāng)對(duì)照葉片上出現(xiàn)病斑時(shí)以及出現(xiàn)病斑2 d 后分別統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。記錄各處理發(fā)病植株數(shù)及發(fā)病嚴(yán)重度,根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0 級(jí)表示無(wú)?。? 級(jí)表示病斑面積占全葉10%以下;2 級(jí)表示病斑面積占全葉10%~30%;3級(jí)表示病斑面積占全葉31%~50%;4 級(jí)表示病斑面積占全葉51%以上[13]。
采用Excel 2003 軟件計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,并進(jìn)行繪圖;利用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan 法進(jìn)行多重比較。
根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣等特征對(duì)油菜內(nèi)生菌比較去冗余后,利用PDA 加富培養(yǎng)基共分離出72 株內(nèi)生菌。用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩后,發(fā)現(xiàn)有6 株菌株對(duì)核盤(pán)菌有抑制作用。牛津杯法復(fù)篩結(jié)果(圖1)表明,菌株1-4、7-3 抑菌圈直徑較大,其中菌株1-4 對(duì)油菜核盤(pán)菌的抑制能力最強(qiáng)。采用連續(xù)傳代法對(duì)菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖2 所示,菌株1-4 發(fā)酵液的抑菌活性在傳代過(guò)程中無(wú)顯著改變,說(shuō)明其遺傳穩(wěn)定性好。因此,選擇該菌株進(jìn)行下一步研究。
圖1 篩選出的拮抗內(nèi)生菌對(duì)核盤(pán)菌的抑菌效果
圖2 菌株1-4 抑菌能力的遺傳穩(wěn)定性
菌株1-4 在牛肉膏蛋白胨平板上形成的菌落呈圓形,表面粗糙,邊緣不整齊,無(wú)色素產(chǎn)生;在油鏡下,菌體為中等長(zhǎng)度桿狀,單生,產(chǎn)芽孢(圖3),革蘭氏染色呈陽(yáng)性。菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示,這些生理生化特性與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中對(duì)地衣芽孢桿菌的描述一致。
圖3 菌株1-4 的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征(×1 000 倍)
表1 菌株1-4 的生理生化試驗(yàn)結(jié)果
PCR 擴(kuò)增獲得菌株1-4 的 16S rDNA 序列長(zhǎng)度為 1 430 bp(Genbank 登錄號(hào):MZ520363),將其與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行BLAST 比對(duì),菌株與Bacillus licheniformisDSM 13 的相似性較高,基于其16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4 所示。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析的結(jié)果,可確定菌株1-4 為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
圖4 基于菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
盆栽試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示,試驗(yàn)48 h 時(shí),菌株1-4 的菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液處理組的油菜菌核病病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照組,防治效果分別為84.84%、76.07%,說(shuō)明菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液處理對(duì)油菜菌核病均有顯著抑制效果。試驗(yàn)96 h 時(shí),各處理組油菜的病情指數(shù)不斷增大,菌懸液、無(wú)菌發(fā)酵液處理的防治效果分別為78.22%、69.95%,比之前有所降低,但仍具有較好的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果還顯示,菌懸液處理的防治效果顯著高于同時(shí)期無(wú)菌發(fā)酵液處理,說(shuō)明活菌體才是防治效果發(fā)揮的根本原因。
表2 菌株1-4 對(duì)油菜菌核病的盆栽防治效果
該研究從健壯油菜植株內(nèi)分離得到72 株內(nèi)生菌,通過(guò)平板對(duì)峙法和牛津杯法篩選到6 株對(duì)油菜菌核病致病菌核盤(pán)菌具有拮抗活性的內(nèi)生菌。其中,菌株1-4對(duì)核盤(pán)菌的抑制作用非常顯著,且經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后,其抑菌特性能夠穩(wěn)定遺傳。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析,將菌株1-4 鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌株的菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液均對(duì)油菜菌核病有較好的防治效果,且菌懸液處理的防效優(yōu)于無(wú)菌發(fā)酵液。
目前,科技工作者主要從農(nóng)作物根際土壤微生物和作物內(nèi)生菌中篩選病蟲(chóng)害生防菌。相對(duì)于根際土壤微生物,作物內(nèi)生菌是一類(lèi)與植物互惠共生的微生物,可以提高作物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力,生物安全性高。地衣芽孢桿菌是一種廣泛應(yīng)用的生防菌,對(duì)稻瘟病菌、輪紋病菌、青霉病菌、枯萎病菌等具有一定的防效。據(jù)統(tǒng)計(jì)(截至2020 年9 月),地衣芽孢桿菌在7 051 種登記的微生物菌肥產(chǎn)品中的應(yīng)用頻次為1 517 次,應(yīng)用率為21.51%,應(yīng)用非常廣泛[14]。該類(lèi)生防菌的安全性高、生長(zhǎng)快、抗逆能力強(qiáng),故該試驗(yàn)篩選獲得的拮抗菌1-4 具有良好的應(yīng)用前景。
拮抗菌1-4 的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病也有顯著的防治效果,說(shuō)明其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了某些抑制核盤(pán)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。孫啟利等[15]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌W10 產(chǎn)生的抗菌蛋白可顯著抑制病菌的生長(zhǎng),而菌株1-4 是否也可產(chǎn)生類(lèi)似的抗菌蛋白,有待進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)中,菌懸液處理的防治效果顯著優(yōu)于同時(shí)期無(wú)菌發(fā)酵液處理,其原因可能是菌懸液中的活菌體能夠在油菜上定殖,循環(huán)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)[10]。