王光梅，楊麗花，羅王勇，字韶興，王正源，周麗華，戶艷霞

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2. 大理州煙草公司漾濞縣分公司，云南 漾濞 672500；3. 大理州煙草公司永平縣分公司，云南 永平 672100；4. 大理州煙草公司彌渡縣分公司，云南 彌渡 675600；5. 云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

煙草黑脛病（Tobacco black shank）是由煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起的一種典型的土傳病害，其病原菌可在土壤中存活數(shù)年并具有累積效應(yīng)，可侵染煙株各生長階段，已成為煙草生產(chǎn)上最頑固的病害之一[1]。該病是Van Breda de Haan 于1896年在印度尼西亞首次發(fā)現(xiàn)并定名[2]，其發(fā)生范圍廣，危害重且防治難度較大。在煙草還苗期、伸根期、旺長期、成熟期，莖基部和根部均會(huì)遭受該病菌的侵染。感染初期，莖基部會(huì)出現(xiàn)黑色斑塊，隨著時(shí)間的推移病斑逐漸向上延伸擴(kuò)展到髓部，導(dǎo)致煙株自下而上變黃，嚴(yán)重時(shí)全株葉片還會(huì)突然凋萎，莖基部和根部壞死。綜合來講，感染了煙草黑脛病的煙草植株會(huì)出現(xiàn)“黑脛”“穿大褂”“黑膏藥”“碟片狀”和“腰漏”等癥狀[3]。而且煙草黑脛病除了單獨(dú)發(fā)生之外往往還會(huì)與煙草青枯病以及根黑腐病一起復(fù)合侵染，使煙葉的質(zhì)量和產(chǎn)量下降，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)造成的損失達(dá)到75%及以上，有的甚至可能導(dǎo)致絕收[4]，嚴(yán)重影響了種煙農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)收益。

近年來，煙草黑脛病在云南省各地都有不同程度的發(fā)生，影響了云南省的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。由于農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，作物的復(fù)種指數(shù)不斷提高[5]；加上不合理的耕作方式使得以化學(xué)農(nóng)藥和培育抗病品種為基礎(chǔ)的防治措施存在諸多弊端；病原菌在土壤中逐年積累，煙草黑脛病的發(fā)病率越來越高，而且病原菌的抗藥性越來越強(qiáng)，同時(shí)伴隨著農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生態(tài)平衡被破壞、煙葉品質(zhì)降低等一系列問題的出現(xiàn)。為響應(yīng)“綠色生產(chǎn)，綠色防控”的號召，保證穩(wěn)產(chǎn)、穩(wěn)收，生物防治不失為一個(gè)行之有效的方法。因此，利用有益生物防治煙草黑脛病越來越受到人們的青睞[6]。

易龍等[7]研究表明，生物防治是利用有益微生物攻擊病原菌（產(chǎn)生抗菌物質(zhì)破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)），或者競爭作用（和病原菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)和生長空間）以及拮抗作用（抑制病原菌的孢子萌發(fā)）讓土壤中黑脛病病原物的數(shù)量減少。其作用機(jī)制是通過有益微生物在植物根部和根際土壤中定殖產(chǎn)生抗生物質(zhì)，降低病原菌的種群密度，防止病原菌的入侵，從而達(dá)到防治病害的作用。李苗苗等[8]的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對煙草黑脛病的防治效果為51.42%。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）會(huì)產(chǎn)生一種抗菌蛋白類物質(zhì)[9]，該蛋白質(zhì)有良好的溶菌作用、競爭作用和較高的抗逆性，用灌根處理的方法可讓作物根際微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性有所改善，從而起到抑制煙草黑脛病病原菌生長的效果[10]。此外，枯草芽孢桿菌的菌絲還可在煙草根系中定殖使病原菌不能侵染或侵染的機(jī)會(huì)減少。王革等[2]通過盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其篩選的長枝木霉（Trichodermalongibrachiatum）對煙草黑脛病的防治效果分別達(dá)到97.6%和67.0%。木霉菌（Trichodermaspp.）可以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)（次級代謝產(chǎn)物和細(xì)胞壁降解酶）[11]，通過競爭、重寄生、抗生、誘導(dǎo)抗性、協(xié)同拮抗等作用機(jī)制來抑制病原菌的入侵[12]。因此，筆者擬開展木霉菌和枯草芽孢桿菌及其復(fù)配劑對煙草黑脛病的防治研究，以期為煙草黑脛病防治提供更好的生防菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及供試材料

田間試驗(yàn)于2020 年6 月—10 月在云南大理彌渡縣紅巖鎮(zhèn)丁家營村展開，大田土壤類型為紅壤，前作植物為大蒜。試驗(yàn)地陽光充足，氣候溫暖濕潤，地勢平坦，全年平均氣溫12～24℃，年降水量810 ～ 850 mm，平均海拔為1 800 m，比較適合煙草的種植。溫室盆栽試驗(yàn)在大理彌渡縣紅花大金元科技示范基地展開，供試土壤為紅壤新土。

供試煙草品種為紅花大金元。供試藥劑：孢子數(shù)為2 億個(gè)/g 的木霉菌可濕性粉劑（上海萬力華生物科技有限公司），芽孢數(shù)為1 000 億個(gè)/g 的枯草芽孢桿菌（德強(qiáng)生物股份有限公司），72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（江蘇寶靈化工股份有限公司）。

參照許學(xué)明[13]的方法，將煙草黑脛病病株用無菌水清洗后，進(jìn)行表面消毒，然后解剖病健交界處的皮層或者髓部組織塊，用0.1%升汞、70%酒精漂洗，再使用無菌濾紙吸干水分后移入燕麥瓊脂培養(yǎng)基中，隨后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日即得供試病原菌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分田間試驗(yàn)和溫室盆栽試驗(yàn)。調(diào)查不同藥劑處理后煙草黑脛病的發(fā)病情況，評估發(fā)病等級后，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)藥劑處理和1 個(gè)對照（表1），每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，共25 小區(qū)，采用隨機(jī)區(qū)組排列。每小區(qū)種植10 株烤煙，小區(qū)間間隔1 株。

表1 不同處理的藥劑及用量

利用灌根施藥的方法進(jìn)行3 次施藥，每次按照用量對水，每株施藥200 mL。第一次施藥與煙苗移栽同步進(jìn)行，隨后2 次施藥以10 d 為一個(gè)周期開展。

1.2.2 溫室盆栽試驗(yàn)同田間試驗(yàn)一樣，設(shè)置4 個(gè)藥劑處理和1 個(gè)對照，每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，共25 小區(qū)，250 株盆栽，以10 d 為一個(gè)周期進(jìn)行施藥（一共3 次）、病害調(diào)查、農(nóng)藝性狀測量。不同的是：每小區(qū)10 株煙苗按順序排列，對每株煙的土壤進(jìn)行黑脛病病原菌的接種。接種方法為：將培養(yǎng)好的煙草疫霉菌菌種（3瓶，約600 g）先用約2 kg 濕潤細(xì)土稀釋拌勻，再加5 kg 濕潤細(xì)土繼續(xù)拌勻，再加5 kg 濕潤細(xì)土繼續(xù)拌勻。每株煙苗施用200 mL 的菌土，將其與煙根附近的土拌勻。

1.3 觀測項(xiàng)目與方法

煙苗移栽10 d 后測定煙株的農(nóng)藝性狀，并且采用蔡勇[14]的方法調(diào)查煙草黑脛病的發(fā)病情況，根據(jù)GB/T23222—2008[15]劃分煙草黑脛病的病情等級。0級：全株無?。? 級：莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3 以下葉片輕度凋萎；3 級：莖部病斑環(huán)繞莖圍的1/3～1/2，或1/3～1/2 葉片凋萎；5 級：莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部圍繞莖圍，或超過1/3～1/2 葉片凋萎；7 級：莖部病斑全部圍繞莖圍，或2/3 以上葉片凋萎；9 級：病株全部葉片凋萎或枯死。

發(fā)病率、病情指數(shù)與防治效果計(jì)算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間試驗(yàn)結(jié)果

從表2 可以看出，各藥劑處理對煙草黑脛病都有一定的防治效果。從8 月4 日調(diào)查的田間黑脛病發(fā)病率情況可知，CK（清水組）的發(fā)病率最高，為5.0%；T1～T4 處理暫時(shí)都沒有黑脛病的發(fā)生。8 月14 日調(diào)查結(jié)果中，各處理的發(fā)病率都比8 月4 日的發(fā)病率有所升高。8 月24 日的田間病情調(diào)查情況顯示，4 種藥劑處理的發(fā)病率均比上一次的調(diào)查結(jié)果高；其中，T4處理的發(fā)病率最低，僅為7.5%；其次為T2 處理，發(fā)病率為12.5%；然后是T1 處理，發(fā)病率是15.0%； T3處理的發(fā)病率為20.0%，僅次于CK（27.5%）。從8 月24的防效結(jié)果可看出，防治效果最好的是T4處理（72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑），其防治效果為72.7%，其次是T2 處理（枯草芽孢桿菌可濕性粉劑），其防效為62.5%，第三是T1 處理（木霉菌可濕性粉劑），防效為61.3%，第四是T3 處理（木霉菌可濕性粉劑+枯草芽孢桿菌可濕性粉劑），防效為57.9%。從表1 還可看出，4 個(gè)藥劑處理的病情指數(shù)極顯著低于CK（P＜0.01），但各藥劑處理之間沒有顯著差異，表明4 種藥劑對煙草黑脛病的田間防效顯著，且各藥劑的防效無明顯差異。

表2 田間試驗(yàn)中不同藥劑對煙草黑脛病的防治效果

2.2 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，8 月4 日的盆栽中CK 的黑脛病發(fā)病率最高，為27.5%；T1、T2、T3、T4 處理都有不同程度的黑脛病發(fā)生。8 月14 日調(diào)查結(jié)果中，CK 和其他藥劑處理的發(fā)病率都有所升高。由8 月24 日調(diào)查中可知，發(fā)病率最低的為T4 處理，為27.5%；其次為T1、T2 處理，均為30.0%；再次為T3 處理，為35.0%，發(fā)病率最高的是CK，為47.5%。從8 月24日中的防效來看，各藥劑處理的防治效果從高到低依次為T4 ＞T2 ＞T1 ＞T3。從表2 還可看出，4 個(gè)藥劑處理的病情指數(shù)極顯著低于CK（P＜0.01），但各藥劑處理之間沒有顯著差異，表明4 種藥劑對煙草黑脛病的盆栽試驗(yàn)防效顯著，且各藥劑的防效無明顯差異。

表3 盆栽試驗(yàn)中不同藥劑對煙草黑脛病的防治效果

3 結(jié)論與討論

綜合田間試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)的數(shù)據(jù)來看，化學(xué)藥劑72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑的防治效果最好，田間試驗(yàn)防效達(dá)72.7%，這與楊慶焱[16]使用72%甲霜·錳鋅1 000 倍液獲得的防效值（74.14%）差異不大；生物制劑木霉菌可濕性粉劑和枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對煙草黑脛病病原菌有一定的防治效果，但其防效稍低于化學(xué)藥劑72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑，但差異不顯著。然而陳志敏等[17]的盆栽試驗(yàn)研究表明，木霉菌TG050609 對煙草黑脛病的防治效果略優(yōu)于58%甲霜靈錳鋅WP，這與筆者的試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是所施藥劑濃度和供試煙草品種不同造成的。由此可知，為了提高煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，保證煙葉的安全性，篩選出低毒、低殘留、低價(jià)位的生防菌劑[16]，利用生物防治手段來防治煙草黑脛病是一個(gè)行之有效的方法。田間試驗(yàn)與盆栽試驗(yàn)對比來看，盆栽試驗(yàn)比田間試驗(yàn)的發(fā)病率、病情指數(shù)高，可能是因?yàn)榕柙栽囼?yàn)中接種的黑脛病病原菌活力強(qiáng)，再加上大棚高溫高濕條件，有利于黑脛病的發(fā)生，所以發(fā)病率和病情指數(shù)偏高。

生物制劑和化學(xué)藥劑對煙草黑脛病的防控都有良好的效果，但是在生物制劑中，芽孢數(shù)為1 000 億個(gè)/g的枯草芽孢桿菌的防治效果稍優(yōu)于孢子數(shù)為2 億個(gè)/g的木霉菌可濕性粉劑。雖然化學(xué)藥劑72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑的防治效果最好，而且高效、速效、使用方便、經(jīng)濟(jì)效益高，但是農(nóng)藥使用不當(dāng)容易引起人、畜中毒，造成環(huán)境污染，殺傷天敵引起次要害蟲再猖獗，并且長期使用同一種農(nóng)藥，可使某些病害產(chǎn)生不同程度的抗藥性[18]。在今后煙草黑脛病的防治中，應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)黑脛病病菌生防菌株的篩選，并充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良生防菌株[19]，提高生防菌對煙草黑脛病的防治效果，降低對人畜及環(huán)境的傷害。