薛 艷， 王佳佳， 王馥香， 任秋偉

（1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，河南 南陽(yáng) 473000；2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院病理科，河南 南陽(yáng) 473000；3.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 南陽(yáng) 473000）

卵巢癌是臨床較為常見(jiàn)的嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。由于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌不易被察覺(jué)，多數(shù)患者被確診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致患者5年生存率較低。為提高Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌的診斷效率，尋找靈敏、便捷、創(chuàng)傷性小的生物學(xué)指標(biāo)已成為臨床研究熱點(diǎn)[1]。有研究結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)氯通道蛋白4（chloride intracellular channel protein 4，CLIC4）高表達(dá)與多種癌癥惡性狀態(tài)及預(yù)后顯著相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，30例卵巢癌患者中有28例CLIC4和卵巢癌特異性蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白呈高表達(dá)[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表觀遺傳、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面顯著影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等。小核仁RNA宿主基因3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）是近期發(fā)現(xiàn)的與肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤惡性狀態(tài)及預(yù)后不良有關(guān)的因子[4-5]，但尚缺少關(guān)于SNHG3對(duì)Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)作用的研究。為此，本研究擬通過(guò)探討Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌組織中CLIC4、SNHG3的表達(dá)與臨床特征因素之間的關(guān)系及其對(duì)患者預(yù)后的影響，為臨床提高Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的診斷效率提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年10月—2015年10月南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院行全面分期手術(shù)治療的Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者113例（卵巢癌組），年齡（49.83±9.94）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)冰凍及石蠟病理學(xué)切片確診為卵巢癌，采用2013年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（the International Federation of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行病理分期，所有患者分期均處于Ⅰ～Ⅱ期；（2）均為初次診斷，且肝、腎功能均正常；（3）病灶組織僅位于卵巢一側(cè)或雙側(cè)，術(shù)前、術(shù)中檢查無(wú)腹水或僅有少量腹水；（4）入組前未行放化療以及盆腔器官手術(shù)治療。另選取同期南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院經(jīng)B超或其他影像學(xué)檢查及病理組織切片確診為良性卵巢囊腫的患者76例（對(duì)照組），年齡（48.79±9.06）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有婦科炎癥患者；（2）伴有其他腫瘤者；（3）伴有高血壓、糖尿病以及心血管等慢性疾病者。本研究經(jīng)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)治療方法 在術(shù)中探查腹腔，確定腫瘤位置、性質(zhì)及包膜的完整情況，同時(shí)根據(jù)患者有無(wú)生育要求等采取不同的手術(shù)方式。對(duì)于腫瘤最大直徑<10 cm的患者行腹腔鏡全面分期手術(shù)，對(duì)于腫瘤最大直徑≥10 cm且粘連嚴(yán)重的患者采用開(kāi)腹全面分期手術(shù)。根據(jù)術(shù)式不同，113例卵巢癌患者中有78例行腹腔鏡全面分期手術(shù)，35例行開(kāi)腹全面分期手術(shù)。對(duì)照組均采用手術(shù)治療。

1.2.2 資料收集 收集所有研究對(duì)象的基線資料，包括：（1）年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)、絕經(jīng)狀況以及月經(jīng)紊亂情況；（2）卵巢癌患者腫瘤分期、病理類(lèi)型、腫瘤直徑、組織病理學(xué)分級(jí)以及是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移等；（3）所有研究對(duì)象相關(guān)指標(biāo)[糖類(lèi)抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）]、人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）、CLIC4及SNHG3等]的檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)CA125、HE4的檢測(cè)結(jié)果及研究對(duì)象的絕經(jīng)情況計(jì)算卵巢惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)（the risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA）指數(shù)，用于評(píng)估卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，計(jì)算公式[7]為：絕經(jīng)前預(yù)測(cè)指數(shù)（predictive index，PI）=-12.0+2.38×ln（HE4）+0.0626×ln（CA125）；絕經(jīng)后PI=-8.09+1.04×ln（HE4）+0.732×ln（CA125），式中l(wèi)n為自然對(duì)數(shù)；ROMA指數(shù)=exp（PI）/[1+exp（PI）] ×100。ROMA指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)特異性為75%時(shí)，絕經(jīng)前ROMA指數(shù)>11.4%、絕經(jīng)后ROMA指數(shù)>29.9%提示卵巢癌高風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.3 HE4、CA125的檢測(cè) 收集所有研究對(duì)象術(shù)前晨起空腹肘靜脈血5 mL，置于無(wú)抗凝劑的Eppendorf管中，靜置10 min后500×g低溫離心15 min，分離血清，置-40 ℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HE4，試劑購(gòu)自美國(guó)R&D公司。采用cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測(cè)CA125。

1.2.4 組織樣本中CLIC4表達(dá)的檢測(cè) 術(shù)中獲得的病理組織樣本部分用于免疫組化檢測(cè)，部分用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)。組織樣本經(jīng)石蠟包埋切片后，采用免疫組化SP試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行檢測(cè)。主要步驟：將石蠟組織切片、脫蠟、水化，經(jīng)乙醇梯度洗脫后，采用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗，將切片組織置于檸檬酸抗原修復(fù)液中洗滌，沖洗后加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，經(jīng)血清封閉，滴加一抗（兔抗人單克隆CLIC4抗體，稀釋濃度為1∶100，美國(guó)Santa Cruz公司），加入二抗（山羊抗兔IgG抗體），PBS清洗后，加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，然后復(fù)染、分化、脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為CLIC4陽(yáng)性。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量分析：陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；根據(jù)細(xì)胞著色深淺進(jìn)行評(píng)分，未染色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；綜合2項(xiàng)評(píng)分，0～1分判定為陰性（-）、1～4分為弱陽(yáng)性（+）、5～8分為陽(yáng)性（++）、9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）；將陰性和弱陽(yáng)性定義為低表達(dá)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性定義為高表達(dá)。計(jì)算CLIC4陽(yáng)性細(xì)胞染色率：在CX31型電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察每個(gè)切面內(nèi)2 000個(gè)以上的細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞染色百分率，采用Image Pro Plus病理圖像分析軟件（美國(guó)MEDIA CYBERNETICS圖像技術(shù)公司）對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行分析，計(jì)算染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SNHG3的表達(dá) 采用PrimeScript RT Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）提取組織樣本中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。檢測(cè)儀器為SimpliAmp PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL，雙蒸水0.6 μL，Rox-Dye 0.4 μL。引物序列：SNHG3上游引物為5'-GTCAGCTACATCTTCATTCACTAC-3'、下游引物為5'-AGTGTCAGTTTAAGGTTACGC-3'；內(nèi)參基因β-actin上游引物為5'-TGCAAACCTGTCCGGCAGCTGTTA-3'、下游引物為5'-GCCCTAAAGTCGTGACCAGC-3'。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；40個(gè)循環(huán)。對(duì)每個(gè)循環(huán)后的SYBR Green進(jìn)行熒光信號(hào)檢查，采用熔解曲線監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物純度。重復(fù)檢測(cè)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。ΔΔCt=ΔCt卵巢癌組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。將卵巢癌組織中SNHG3相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)作為臨界值，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2.6 隨訪 采用電話、門(mén)診復(fù)診等方式對(duì)113例卵巢癌患者進(jìn)行隨訪。收集患者預(yù)后生存及生活質(zhì)量情況。隨訪截止時(shí)間為2019年4月30日，隨訪中位時(shí)間為39個(gè)月，隨訪至患者死亡或到隨訪截止時(shí)間為止。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件及Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非配對(duì)t檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）（范圍）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線分析CLIC4、SNHG3對(duì)卵巢癌預(yù)后的影響，比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox比例回歸分析評(píng)估Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌預(yù)后的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組與對(duì)照組一般資料的比較

卵巢癌組CA125、HE4、ROMA指數(shù)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），年齡、BMI和經(jīng)產(chǎn)次數(shù)2個(gè)組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌組與對(duì)照組一般臨床資料比較

2.2 卵巢癌組與對(duì)照組組織中CLIC4表達(dá)的比較

免疫組化結(jié)果顯示，卵巢癌組CLIC4陽(yáng)性的高表達(dá)率及CLIC4免疫組化積分百分率顯著高于對(duì)照組（P<0.001）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 卵巢癌組和對(duì)照組CLIC4表達(dá)情況比較

圖1 卵巢癌組與對(duì)照組免疫組化檢測(cè)結(jié)果

2.3 卵巢癌組與對(duì)照組組織樣本中SNHG3相對(duì)表達(dá)量的比較

卵巢癌組SNHG3的相對(duì)表達(dá)量為0.726±0.097，顯著高于對(duì)照組（0.325±0.062）（P<0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 卵巢癌組與對(duì)照組組織樣本中SNHG3相對(duì)表達(dá)量的比較

2.4 CLIC4、SNHG3表達(dá)與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

CLIC4高表達(dá)與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者的病理類(lèi)型（漿液性癌）、組織學(xué)分級(jí)（G2～G3級(jí)）、臨床分期（Ⅱ期）有關(guān)（P<0.05）。進(jìn)一步分析不同病理類(lèi)型患者之間CLIC4表達(dá)的差異，結(jié)果顯示，漿液性癌患者、黏液性癌患者與子宮內(nèi)膜樣癌患者CLIC4表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2值分別為16.878、15.990，P=0.000），其他病理類(lèi)型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。根據(jù)SNHG3相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（0.657）將卵巢癌患者分為高表達(dá)（SNHG3>0.657）和低表達(dá)（SNHG3≤0.657），結(jié)果顯示SNHG3高表達(dá)與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期有關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 CLIC4、SNHG3表達(dá)與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.5 CLIC4、SNHG3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪結(jié)果顯示，113例Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者5年內(nèi)有30例（26.55%）復(fù)發(fā)、13例（11.50%）死亡。CLIC4高表達(dá)組總體生存率（overall survival rate，OS）、疾病無(wú)進(jìn)展生存率（disease progression-free survival rate，PFS）均低于CLIC4低表達(dá)組（Log-rankχ2值分別為5.108、6.541，P<0.05）。SNHG3高表達(dá)組OS、PFS均低于SNHG3低表達(dá)組（Log-rankχ2值分別為5.467、6.626，P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 CLIC4、SNHG3對(duì)Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預(yù)后影響的Kaplan-Meier曲線

2.6 Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌預(yù)后影響因素的分析

Cox比例回歸分析結(jié)果顯示，CA125、HE4、CLIC4、SNHG3、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期均是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預(yù)后（生存）的影響因素。見(jiàn)表4。

表4 Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預(yù)后（生存）的影響因素

3 討論

有研究結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者5年生存率明顯高于晚期卵巢癌患者[7]。因此，對(duì)于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的研究熱點(diǎn)多集中于尋找靈敏、便捷、創(chuàng)傷性小的生物學(xué)指標(biāo)，以提高Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的診斷效率。目前，研究較多的生物學(xué)指標(biāo)有CA125、HE4、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子等，其中CA125是輔助診斷卵巢癌最常用的指標(biāo)，但CA125存在一定比例的假陽(yáng)性，且敏感性較低，因此其作為早期卵巢癌的診斷標(biāo)志物存在一定的局限性[8-11]。CLIC4是細(xì)胞內(nèi)的一種氯通道，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞體積的變化。CLIC4在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌中呈高表達(dá)，而在正常組織中幾乎不表達(dá)；CLIC4的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)[12]。SINGHA等[13]的研究結(jié)果顯示，CLIC4對(duì)早期或低分級(jí)卵巢癌的診斷具有更高的價(jià)值，診斷效能明顯優(yōu)于CA125。CLIC4高表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌組織中的纖維母細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于CLIC4與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系以及CLIC4在卵巢癌預(yù)后評(píng)估中的作用的研究較少。為此，本研究探討了CLIC4在Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌中的價(jià)值。結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者組織中CLIC4的表達(dá)量顯著高于良性卵巢囊腫患者（P<0.001）。隨訪結(jié)果也顯示，CLIC4是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預(yù)后的影響因素（RR=2.797，95%可信區(qū)間為1.308～7.224）。

腫瘤組織中存在異常表達(dá)的lncRNA，在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過(guò)程發(fā)揮作用，提示部分lncRNA或可作為腫瘤診斷的潛在的生物標(biāo)志物[15]。SNHG3是大腸埃希菌U17菌株的宿主基因，位于1號(hào)染色體短臂3區(qū)6號(hào)帶。有研究結(jié)果顯示，SNHG3與肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等惡性腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)[16-17]。有研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中SNHG3呈高表達(dá)，較高的SNHG3表達(dá)量預(yù)示著卵巢癌患者預(yù)后不良[18]。本研究結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者組織中SNHG3的相對(duì)表達(dá)量顯著高于良性卵巢囊腫患者（P<0.001），且SNHG3表達(dá)與卵巢癌的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)等有關(guān)，提示SNHG3對(duì)Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌病情的判斷有一定價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，漿液性卵巢癌患者組織樣本中CLIC4表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于其他病理類(lèi)型（P=0.000），但預(yù)后分析并未發(fā)現(xiàn)病理類(lèi)型是卵巢癌患者預(yù)后的影響因素，這可能與漿液性卵巢癌是卵巢癌中最為常見(jiàn)的病理類(lèi)型有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，組織學(xué)分級(jí)G2～G3級(jí)、臨床分期Ⅱ期的卵巢癌患者組織中CLIC4、SNHG3表達(dá)均分別高于G1級(jí)、臨床分期Ⅰ期（P<0.05），且組織學(xué)分級(jí)及臨床分期是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預(yù)后的影響因素（RR分別為2.886、2.032，95%可信區(qū)間分別為1.373～8.005、1.199～7.522）。

本研究尚存在一定的不足之處：（1）未將CLIC4、SNHG3與HE4、CA125等傳統(tǒng)指標(biāo)進(jìn)行比較，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討CLIC4、SNHG3及HE4、CA125等傳統(tǒng)指標(biāo)與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系；（2）本研究獲的樣本主要為卵巢癌組織，因此不利于臨床診斷，后續(xù)將探討在一些更易獲取的樣本，如外周血樣本中，CLIC4、SNHG3是否具有與組織樣本一樣的臨床價(jià)值，以提高診斷的便捷性與靈敏度。

綜上所述，CLIC4、SNHG3高表達(dá)與Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌的臨床病理特征、預(yù)后均顯著相關(guān)。CLIC4、SNHG3是Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者預(yù)后（生存）的影響因素。