田亮金，朱薇薇，蔡 巖，張冬冬，姜 柳，張 倩，關(guān)博元，王世鋒

（1.海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南?？?570228；2.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室，海南?？?570228）

蝦醬（Shrimp Paste）又名蝦膏，全國科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會將其定義為“毛蝦等小型蝦類經(jīng)腌制、搗碎、發(fā)酵制成的糊狀食品”［1］.在傳統(tǒng)蝦醬生產(chǎn)工藝中，蝦體表及體內(nèi)的微生物是蝦醬發(fā)酵的主要微生物類群，包括乳酸桿菌屬（Lactob acillusspp.）、酵母菌屬（Sacch aromycesspp.）、片球菌屬（Pedi ococcusspp.）、芽孢桿菌屬（Baci llusspp.）等［2-3］，由于在生產(chǎn)期間很少滅菌，這些天然共生的微生物在蝦醬中存活了下來［4-5］.有研究表明，芽孢桿菌屬是蝦醬微生物群落中的重要組成部分［6］.

芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，可通過食物進入動物的胃腸道［7］.在眾多水生動物中，芽孢桿菌屬是研究最多的益生菌，作為微生態(tài)制劑添加到飼料中促進了水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的開發(fā)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［8］.許多研究表明，芽孢桿菌可以對動物起到很好的益生效果，具有產(chǎn)酶活性的芽孢桿菌可以增強宿主的生長性能［9-11］；其抗菌活性可以抑制腸道病原菌，改善腸道菌群環(huán)境［12］；其產(chǎn)酸能力也可抑制腸道中對酸敏感的病原菌［13］；分泌的多種物質(zhì)可以提高宿主消化酶活性和抗氧化活性［9-10，14］；且可顯著降低水體中NH+4-N、NO-2-N含量，改善水體環(huán)境等［15］.同時，益生菌應(yīng)對腸胃環(huán)境有一定的耐受力，粘附性和疏水活性也間接反映其定植能力［16-17］.因此，本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的蝦醬為材料，篩選出可以產(chǎn)酸的，具有較強產(chǎn)酶能力、抗病原菌、對抗生素敏感的潛在益生菌，并測定株菌的耐受性、粘附性、表面疏水活性，以期篩選優(yōu)良的益生菌株，為開發(fā)水產(chǎn)動物益生菌制劑提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 材料蝦醬購于?？谑忻捞m區(qū)某食用品雜貨店，分別為定安定城益民調(diào)味廠生產(chǎn)的幫輝海蝦調(diào)味醬（500 g，A醬）和?？诒镜匚r醬（500 g，無商標(biāo)，B醬）.

指示菌無乳鏈球菌S treptococcus a gal act iae、嗜水氣單胞菌Aeromonas h ydro phila、哈維氏弧菌Vi bri o h arveyi、溶藻弧菌V.alginol yticus和鰻弧菌V.an gui llarum均由本課題組前期分離得到，保存于-80℃冰箱.

1.2 培養(yǎng)基BCP培養(yǎng)基：乳糖5 g，蛋白胨5 g，酵母膏3 g，瓊脂18 g，H2O 1 000 mL，0.5%溴甲酚紫溶液10 mL，pH 7.0.

脫脂牛奶固體培養(yǎng)基：瓊脂18 g，H2O 900 mL，pH值7.0.滅菌后冷卻至60℃時加入100 mL脫脂牛奶.

淀粉固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、牛肉膏5 g、瓊脂粉18 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0.

改良刺激芽孢生長培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，淀粉3 g/L，酵母粉3 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，H2O 1 000 mL，pH 7.0.

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選將蝦醬震蕩混勻后用生理鹽水稀釋10倍，再混勻后取100μL的稀釋液涂布到BCP培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h.挑選出使培養(yǎng)基變黃色，即可以產(chǎn)酸的菌株，在BCP平板上劃線純化，單菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)后，保存于4℃冰箱備用.

1.3.2 溶血活性菌種活化后用接種環(huán)挑取菌液在血瓊脂平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上劃線，在37℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)菌落周圍透明圈的形成檢測菌株的溶血活性.

1.3.3 產(chǎn)酶能力參考Gu等［18］的方法用打孔器在含1%脫脂牛奶的固體培養(yǎng)基（測定蛋白酶）上均勻打孔，每孔加20μL菌液后37℃條件下正置培養(yǎng)24 h，測量水解圈.淀粉酶的測定參考劉觀斌等［19］和Saxena等［20］的方法，用打孔器在淀粉固體培養(yǎng)基上均勻打孔，每孔加20μL菌液后37℃條件下正置培養(yǎng)24 h，加入2 mL的碘液，將碘液均勻覆蓋整個培養(yǎng)基，10 min后記錄藍色培養(yǎng)基上出現(xiàn)水解透明圈的情況并測量其直徑.水解圈大小均以水解圈直徑（mm）減去打孔直徑（mm）表示.

1.3.4 拮抗能力實驗取活化的菌液3μL點種于改良刺激芽孢桿菌固體培養(yǎng)基［21］上，在37℃下正置培養(yǎng)24 h后，將各指示菌的半固體瓊脂培養(yǎng)基（無菌半固體瓊脂∶菌液=9∶1）分別倒板于點種好的改良刺激芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上，倒置37℃培養(yǎng)24 h后測量菌落直徑C（mm）和抗菌圈直徑H（mm）［22］.拮抗活性的大小以抗菌圈直徑H（mm）和菌落直徑C（mm）的比值H/C表示.

1.3.5 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增，50μL反應(yīng)體系為：5μL 10×GC Buffer，4μL dNTPs，上、下游引物（10 mmol/L）1μL，0.5μLTaq酶，1μL DNA模板，37.51μL去離子水.擴增程序為：95℃5 min，94℃30 s，54℃1 min，72℃2 min，30個循環(huán)，72℃10 min.PCR產(chǎn)物凝膠系統(tǒng)檢測后送至上海生工測序.

1.3.6 產(chǎn)酸能力活化的菌種用接種環(huán)挑取1環(huán)，分別接種于裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基（pH 7.2）的50 mL離心管中培養(yǎng)12 h，用pH計測出12 h后的pH值，并進行平板計數(shù)［19］.

1.3.7 耐人工胃腸液對Gebara等［23］的方法略作修改，配制待用溶液：1.12 g/L KCL，0.11 g/L CaCl，0.4 g/L KH2PO4.在待用溶液中加粘蛋白（3.5 g/L），胃蛋白酶（0.26 g/L），加入1 mol/L HCl使pH值至3.0模擬胃液環(huán)境；在待用溶液中加入胰蛋白酶（1.95 g/L），加入1 mol/L NaHCO3使pH值至7.0模擬腸液環(huán)境，配制完成后用0.22μm濾膜過濾除菌.取0.4 mL菌液分別接種到3.6 mL模擬胃液/模擬腸液中，搖床100 r/min、37℃分別培養(yǎng)3 h、4 h后進行菌落計數(shù)，表示為log10CFU mL-1，分別計算存活率.

1.3.8 自凝集率參照Manhar等［24］的方法調(diào)節(jié)菌液OD（600 nm）值為0.8±0.05，室溫靜置培養(yǎng)2 h、4 h、24 h時分別測上層菌液OD值（600 nm）.自凝集率=（At-A0）/A0×100%（式中：A0為600 nm處初始菌液的OD值；At靜置th后上清液在600 nm處的OD值）.

1.3.9 表面疏水活性調(diào)節(jié)菌液的OD值（600 nm）為0.8±0.05，然后將等體積的菌液分別和二甲苯（非極性溶劑）、氯仿（極性酸性溶劑）及乙酸乙酯（極性堿性溶劑）混合［25］，渦旋震蕩2 min后室溫靜置2 h，取水相測其OD值.表面疏水活性=（At-A0）/A0×100%（式中：A0為600 nm處初始菌液的OD值；At靜置th后上清液在600 nm處的OD值）［26］.

1.3.10 藥敏試驗藥敏試驗采用紙片擴散法（K-B法）及瓊脂稀釋法.調(diào)節(jié)菌液濃度至CLSI標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的1.5×108CFU/mL，取300μL培養(yǎng)過夜的菌液到厚度均為4 mm MH瓊脂平板上，涂板晾干后，每個平板均勻貼4個藥敏紙片，每種紙片（杭州微生物試劑有限公司）設(shè)3個重復(fù)，室溫放置15 min后于37℃倒置培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑（mm）.

1.4 數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)用Excel（Excel 2016）、SPSS（19.0）進行圖表繪制及統(tǒng)計學(xué)分析.

2 結(jié)果

2.1 溶血性和產(chǎn)酸能力利用BCP培養(yǎng)基從兩種蝦醬中篩選到306株產(chǎn)酸菌株，再經(jīng)血平板培養(yǎng)篩選得到36株不溶血的菌株：A1、A2、A8、A11、A12、A14、A16、A20、A27、A28、A35、A40、A41、B3、B14、B15、B35、B37、B38、B39、B45、B47、B53、B55、B56、B65、B76、B81、B83、B85、B87、B89、B94、B117、B169、B182.

2.2 產(chǎn)酶能力對36株不溶血的菌株進行產(chǎn)酶能力測定，挑選出產(chǎn)酶能力相對較好的6株菌，并進行顯著性分析，結(jié)果如表1.A27、A35和B47的淀粉酶水解圈大小在4 mm以上，且蛋白酶水解圈大小超過5 mm，顯著高于其他菌株（P＜0.05），A20次之；B3和B89相較于前者，產(chǎn)酶能力一般.

2.3 拮抗能力6株菌的體外拮抗實驗結(jié)果同表1.同時對5種病原菌有拮抗能力的菌株只有A20和B3，并且至少對4種病原菌的拮抗能力顯著高于其它菌株（P＜0.05），A27、A35和B47只對一種病原菌有拮抗能力，且沒有顯著差異（P＞0.05）.部分候選菌株對5種病原菌的拮抗作用如圖1所示.

結(jié)合產(chǎn)酶和拮抗實驗結(jié)果來看，A20的產(chǎn)酶和拮抗能力都較好，A27和B47雖然只對一種病原菌有拮抗能力，但產(chǎn)酶能力突出；B3和B89產(chǎn)酶能力一般，但至少對四種病原菌有一定的拮抗能力，因此選用這6株菌進行后續(xù)的篩選.

2.4 菌落形態(tài)特征菌株活化后在改良刺激芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上劃線，37℃倒置過夜培養(yǎng)后，6株芽孢桿菌菌落形態(tài)如圖2所示.

2.5 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定使用BLAST方法將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌序列進行比對，菌株A20、A27、B3、B89分別與巨大芽孢桿菌MF431757.1、MF431757.1、MK307787.1、MK521072.1序列相似度最高，均達到99%以上，菌株A35、B47分別與枯草芽孢桿菌KU179323.1、彎曲芽孢桿菌MK012676.1序列相似度最高，也達到99%以上.

將比對獲得的序列用MEGA 6軟件進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3，A20、A27、A35、B3、B47、B89這6株菌株均為芽孢桿菌屬，其中，A20、A27、B3、B89為巨大芽孢桿菌（B.me gat erium），A35為枯草芽孢桿菌（B.subt i lis），B47為彎曲芽孢桿菌（B.flexus）.

圖3 6株潛在益生菌的系統(tǒng)進化樹

2.6 產(chǎn)酸能力如表2所示，B47、A20、B89和B3菌株培養(yǎng)12 h后，其菌液pH值的降低值顯著低于與其他菌株（P＜0.05），具有一定的產(chǎn)酸能力.

表2 6株芽孢桿菌12h的產(chǎn)酸能力

2.7 耐人工胃腸液

2.7.1 耐人工胃液由圖4可以得出，當(dāng)人工胃液作用時間為3 h時，B47和B89的存活率顯著高于A35（P＜0.05），但是與A20、A27無顯著差異（P＞0.05）.

圖4 6株芽孢桿菌在人工胃液中3h的存活率［注：各組 數(shù)據(jù)用mean±SD表示，不同字母表示各組間的差異顯著(P＜0.05)］

2.7.2 耐人工腸液由圖5可得，當(dāng)人工腸液作用時間為4 h時A27的存活率最高，為90%，與A20、A35、B3和B47有顯著差異（P＜0.05）.

圖5 6株芽孢桿菌在人工腸液中4h后的存活率［注：各組數(shù)據(jù)用mean±SD表示，不同字母表示各組間的差異顯著（P＜0.05）.］

2.8 自凝集能力自凝集率見圖6，由圖可知A20和A27各個時間段的自凝集效果都比較好，24 h的自凝集率達到了98%及以上；A35、B3和B89的自凝集率在2 h、4 h和24 h時都一般，24 h時達到了70%左右；B47的自凝集效果較差.

圖6 6株芽孢桿菌的自凝集率[注：各組數(shù)據(jù)用mean±SD表示]

2.9 表面疏水活性菌株表面疏水活性結(jié)果見圖7，A35、B3和B89在二甲苯溶劑中的疏水率較高（P＜0.05）；6株菌在氯仿溶劑中的疏水率均超過36%，A35和B89顯著高于其他菌株（P＜0.05）；A35和B89在乙酸乙酯溶劑中的疏水率顯著高于其他菌株（P＜0.05）.綜合來看，A35和B89在這三種溶劑中的疏水率比較高.

圖7 6株芽孢桿菌的表面疏水活性[注：各組數(shù)據(jù)用mean±SD表示，不同字母表示各組間的差異顯著(P＜0.05)]

2.10 藥敏試驗結(jié)果由表3可得，6株芽孢桿菌對26種抗生素的藥敏實驗中，A20對其中的21種抗生素敏感，其敏感率最高為80.8%.A20、A27、A35、B47、B89對青霉素類的阿洛西林和阿莫西林都敏感；6株菌均對糖肽類的萬古霉素、氯霉素類敏感，對桿菌肽耐藥.

表3 6株芽孢桿菌的藥敏試驗

3 討 論

芽孢桿菌是一類應(yīng)用比較廣泛的可飼用益生菌［27］，具有良好的益生作用，并且產(chǎn)生的芽孢生命力強，利于儲存和運輸［28］.產(chǎn)酸的芽孢桿菌還能降低腸道的pH值，抑制病原菌的大量增殖［13］.張飛等［29］在篩選乳酸菌時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH值下降了1.99～2.08，體現(xiàn)出一定的產(chǎn)酸能力，與本研究類似，芽孢桿菌A20、B3、B47和B89在培養(yǎng)12 h后，使培養(yǎng)基pH值下降了1.44～1.71，說明這五株芽孢桿菌也具有一定的產(chǎn)酸能力.

3.1 產(chǎn)酶能力飼料消化率會對養(yǎng)殖魚類的生長和生產(chǎn)成本產(chǎn)生直接影響，而添加產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶等消化酶的芽孢桿菌能夠提高魚類的消化能力［30-32］，促進魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高飼料利用率［9，33-34］.Liu等［9］和Debasis等［35］等發(fā)現(xiàn)將具有淀粉酶和蛋白酶活性的枯草芽孢桿菌（B.subtil us）添加到飼料中并投喂后顯著提高了魚類的特定生長率和增重率.Cai等［10］也將具有這兩種產(chǎn)酶能力的兩株芽孢桿菌分別投喂21天時，發(fā)現(xiàn)顯著促進了對蝦（Lito penaeus vannamei）的生長.孫娜［11］將具有產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶活性的蠟狀芽孢桿菌（B.cer eus）添加于飼料中分別投喂許氏平鲉（S ebastes s ch le gel ii）和大菱鲆（S cophthalmus maximus）幼魚50天后，也發(fā)現(xiàn)增重率和特定生長率顯著提高.Liu等［36］和Han等［37］在各自的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果.本研究中，A20、A27、A35和B47的淀粉酶和蛋白酶水解圈大小均在4 mm以上，具有較強的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的活性，可作為促進水產(chǎn)動物生長性能的候選菌株.

3.2 對病原菌的拮抗能力芽孢桿菌可通過分泌細(xì)菌素、磷脂類、脂肽類等抗菌物質(zhì)，破壞病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，干擾病原菌能量代謝［12］.研究表明，在飼料中添加對病原菌具有拮抗效果的益生菌，可提高機體抵抗病原菌侵染的能力［12，32-33］.Li等［38］發(fā)現(xiàn)一株貝萊斯芽孢桿菌（B.velez ensis）對7種病原菌有抑制活性，在投喂珍珠龍膽石斑魚（E pineph el us lanceol at us♂×E.fus co gut tatus♀）4周后感染哈維氏弧菌，存活率和免疫基因顯著提高（P＜0.05）.Gobi等［39］投喂地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）提高了羅非魚對嗜水氣單胞菌的抵抗力.類似地，Meidong等［40］投喂空氣芽孢桿菌（B.aerius）也增強了巴沙魚（Pan gasius bocourt i）的免疫力和對嗜水氣單胞菌的抵抗力.Nayak等［41］、Kumar等［42］和Wu等［30］也在添加芽孢桿菌后發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果.本研究篩選的A20、B3和B89至少對4種病原菌具有拮抗作用，其中A20對病原菌的拮抗能力最強，對4種水產(chǎn)動物病原菌的拮抗能力顯著高于其它菌株（P＜0.05），作為益生菌添加到飼料中也存在一定的保護潛力.

3.3 腸胃道定植能力腸胃道環(huán)境中的胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶及膽鹽等物質(zhì)會對益生菌的定殖產(chǎn)生不利影響［43］，因此益生菌發(fā)揮功能的前提是要對胃腸道有一定的耐受性［16-17，44］.對益生菌進行耐受性的檢驗是必要的，只有在腸胃環(huán)境中存活并增植到一定的數(shù)量才能發(fā)揮其益生作用［45-46］.吳振超等［47］在研究蠟狀芽孢桿菌對腸胃液的耐受性時發(fā)現(xiàn)，處理4 h后的存活率分別為62.91%和69.54%，體現(xiàn)出較好的耐受能力，與本研究結(jié)果相似.在人工胃液和腸液分別作用3、4小時之后，A20、A27、B47和B89的存活率均高于60%，表明該菌株可以在腸胃道中存活.益生菌益生菌的體外粘附能力和體內(nèi)定植是相關(guān)的［17，48］，自凝集與表面疏水活性是影響兩相反應(yīng)的重要因素之一，與多種黏附作用相關(guān)［49］.自凝聚水平可分為：低（16%～35%），中等（35%～50%）和高（50%以上）三類［50］.在粘附性實驗中，A20和A27 24 h的自凝集率為98%及以上，體現(xiàn)出高自凝性.A35和B89在三種溶劑中都表現(xiàn)出較高的表面疏水活性.

3.3 抗生素敏感性益生菌具有在腸道中轉(zhuǎn)移抗生素抗性基因至病原菌中的潛在能力，因此應(yīng)用前必須先通過體外試驗對其相關(guān)的抗生素易感性進行檢測［51］.在本試驗中，芽孢桿菌A20和A27分別對21、16種抗生素敏感，敏感率比較高的還有A35和B47這2株菌，攜帶耐藥性基因較少，其作為水產(chǎn)微生物制劑成分，耐藥基因轉(zhuǎn)移到病原菌中，提高病原菌耐藥性的可能性較小，在此方面A20具有較好的安全性.

3.4 菌株特異性微生物泛基因組（Pan-genomoe）研究顯示，同種不同菌株間基因組存在差異，根據(jù)基因在不同菌株中基因出現(xiàn)的頻次不同，可分為核心基因、非必需基因和菌株特有基因三部分［52］，根據(jù)中心法則［53］，不同菌株在基因組成上的差異直接決定了其特定功能的有無［54］.因此，即便是同一菌種的不同菌株之間因基因組成的差異，其益生功能特性和安全性等方面也不盡相同，具有菌株特異性［55-57］.可見，在益生菌篩選中通過多項實驗針對特定菌株評價其益生作用是必要的［58］.在本研究中發(fā)現(xiàn)，盡管A20、A27、B3和B89均為巨大芽孢桿菌，但在酶活、病原菌拮抗活性、產(chǎn)酸能力等益生特性均存在一定差異，為今后益生菌的益生機制研究提供了菌種，奠定了基礎(chǔ).

4 結(jié) 論

本研究以蝦醬為原料，比較了菌株的產(chǎn)酸能力、溶血活性、產(chǎn)酶能力、對病原菌的拮抗能力、耐人工胃/腸液、粘附性、表面疏水活性和藥物敏感性等，巨大芽孢桿菌A20無溶血活性，發(fā)酵12小時后可使培養(yǎng)液pH降低1.5；蛋白酶和淀粉酶水解圈大小在4 mm以上；對5種致病菌均具有較強的拮抗能力，H/C比值超過1.5；具有較強的耐人工胃腸液能力，胃、腸液分別處理3、4小時后，菌株存活率在60%左右；24 h自凝集率達98%；A20對21種抗生素敏感，敏感率為80.7%.鑒于其較強的產(chǎn)酶和拮抗能力，同時具有一定的耐受性、粘附性和藥物敏感性，體現(xiàn)出優(yōu)良的益生潛能，可作為潛在益生菌株用于后續(xù)水產(chǎn)動物飼料益生菌制劑的開發(fā)利用.