林茂娟，吳可建，于燕燕，李春霞，陶 均

（海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228）

野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campes trispv.campest ris，Xcc）能夠引起十字花科植物的黑腐病，是研究植物與病原菌相互作用的重要模式細(xì)菌之一［1-2］.病原體產(chǎn)生的胞外酶、胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）、生物被膜（Biofilm）及效應(yīng)因子等是其能夠成功感染并在宿主組織中定殖的關(guān)鍵因素［3-5］.生物被膜的形成在病原體感染寄主植物過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，能夠形成生物被膜的病原菌對(duì)抗生素和宿主免疫防御機(jī)制具有很強(qiáng)的抗性［6-7］.大多數(shù)胞外酶是水解酶或裂解酶，能夠降解宿主植物細(xì)胞壁的纖維素、果膠、蛋白質(zhì)和淀粉等成分，用于侵染初期攻破植物的第一道防線［8］.目前已發(fā)現(xiàn)Ⅱ型分泌系統(tǒng)（Type II secretion system，T2SS）分泌的蛋白酶［9］、纖維素酶（內(nèi)切葡聚糖酶）［10］、淀粉酶［11］和果膠酶（多聚半乳糖醛酸酶）［12］均在Xcc的毒力中發(fā)揮作用.

VemR是一個(gè)僅含有REC（Phosphoacceptor receive）結(jié)構(gòu)域的響應(yīng)調(diào)節(jié)因子（Response regulator，RR），其突變導(dǎo)致Xcc8004菌株的毒力、EPS含量顯著降低.rpo N2、vemR和fleQ基因組成一個(gè)操縱子（圖1）［13］.rpo N2編碼一個(gè)σ54因子，其突變導(dǎo)致柑橘潰瘍病菌Xc1生物被膜和EPS含量減少［14］.fleQ編碼轉(zhuǎn)錄激活因子，在XccXC17菌株中可調(diào)控fliE、f l iL、fli Q、fl gB、flg G、flhF和flhB A等鞭毛合成基因的表達(dá)以及致病力［15-17］.但r po N2-vemR-fleQ操縱子在Xcc中是否調(diào)控胞外酶和生物被膜的生物合成并不清楚.本研究構(gòu)建了r poN2、vemR、f l e Q單突變體、雙突變體以及三重突變體，比較突變體與野生型菌株分泌胞外酶和形成生物被膜的能力，分析rpo N2-vemR-fleQ操縱子對(duì)Xcc8004合成胞外酶和生物被膜的調(diào)控作用，為進(jìn)一步探討病原菌的致病機(jī)制提供參考.

圖1 rpoN2-vemR-fl eQ操縱子及其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒Xcc8004菌株和pK18mob S acB質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌感受態(tài)購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司.

1.2 培養(yǎng)基與試劑LB培養(yǎng)基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl），NYG培養(yǎng)基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%甘油），相應(yīng)的固體培養(yǎng)基另加1.5%的瓊脂.瓊脂糖凝膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司.高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶及T4連接酶購(gòu)自NEB公司.其它試劑購(gòu)自Sigma或廣州化學(xué)試劑公司.

1.3 引物序列根據(jù)敲除基因兩端序列，運(yùn)用軟件Primer 5分析、設(shè)計(jì)引物（表1），并由生工生物工程（廣州）分公司合成.

表1 引物序列

1.4 突變體構(gòu)建以Xcc8004基因組為模板，PCR擴(kuò)增目的基因上下游各約500 bp片段.酶切回收后與pK18mobSacB載體相連，轉(zhuǎn)化E.col iDH5a，經(jīng)酶切鑒定以及測(cè)序確認(rèn)后獲得敲除載體pK18-rpo N2、pK18-vemR、pK18-fleQ、pK18-rpo N2/vemR、pK18-vemR/fleQ、pK18-rpo N2/fleQ、pK18-rpoN2/vemR/fleQ.利用三親接合法將自殺質(zhì)粒pK18mob S ac B轉(zhuǎn)入Xcc8004中，經(jīng)過(guò)兩次交換后獲得突變體菌株，單突變體菌株：Δrpo N2、ΔvemR和ΔfleQ；雙突變體菌株：ΔrpoN2/ΔvemR、ΔvemR/ΔfleQ和ΔrpoN2/ΔfleQ以及三突變體：Δrpo N2/ΔvemR/ΔfleQ.

1.5 生物被膜（Biofilm）含量測(cè)定將待測(cè)菌株于28℃振蕩培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，用NYG培養(yǎng)基清洗兩次后稀釋至OD600=1.0，取2 mL菌液接種到試管中，28℃靜置培養(yǎng)72 h.將菌液吸取干凈后，用ddH2O輕輕清洗兩遍，自然風(fēng)干，加入0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，棄結(jié)晶紫染液，用ddH2O輕輕清洗兩遍后同樣自然風(fēng)干，通過(guò)觀察氣液表面薄膜環(huán)的大小來(lái)推測(cè)菌株Biofilm的形成能力.最后加入等量的90%乙醇溶解20 min，混勻后按200μL/孔加入96孔板于A590 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)［18］.

1.6 胞外酶（蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶）活性測(cè)定將待測(cè)菌株于28℃振蕩培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，用ddH2O清洗兩次后稀釋至OD600=1.0，取2μL菌液接種到分別補(bǔ)充有脫脂奶粉、可溶性淀粉以及羧甲基纖維素的NYG固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h.補(bǔ)充有可溶性淀粉和纖維素的平板分別用1∶100的I2/KI（0.08 M I2，3.2 M KI）和0.1%的剛果紅染液染色.通過(guò)比較D/d（水解產(chǎn)物的直徑（D）和菌落直徑（d））的大小以鑒定菌株產(chǎn)酶能力，D/d值越大，說(shuō)明菌株產(chǎn)酶的能力越強(qiáng)［19］.

2 結(jié)果與分析

2.1 rpoN2/vemR/fleQ突變體菌株的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)以Xcc8004作為野生型菌株（WT），利用三親本接合法經(jīng)過(guò)兩次同源重組將rpoN2、vemR和fleQ敲除.用目的基因兩側(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以Xcc8004為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照.r poN2、vemR和fleQ基因大小分別為1 404 bp、384 bp、1 491 bp.如圖2所示，在相應(yīng)突變體中，野生型擴(kuò)增片段與突變體擴(kuò)增片段大小之差正好符合預(yù)測(cè)敲除基因片段大小，表明突變體已構(gòu)建成功.

圖2 r poN2、ve mR和fleQ突變體PCR檢測(cè)

2.2 VemR、RpoN2和FleQ對(duì)Xcc生物被膜的調(diào)控作用生物被膜（Biofilm）是指粘附在物體表面或界面由蛋白質(zhì)、多糖和DNA等組成的細(xì)菌群體［20］，能夠保護(hù)細(xì)菌免受各種物理、化學(xué)和生物因素的損傷［21］.本研究通過(guò)氣液界面環(huán)形成法以及結(jié)晶紫染色分光光度法檢測(cè)突變體菌株形成Biofilm的能力.如圖3所示，WT菌株形成的氣液界面環(huán)面積較大，表明其形成Biofilm的能力較強(qiáng).與WT相比，vemR突變后，氣液界面環(huán)菌落面積明顯減少，結(jié)晶紫染色的吸光值降低約88.8%.Δr poN2/ΔvemR和ΔvemR/ΔfleQ雙突變體的吸光值較WT分別降低約75.3%和64.6%，表明ΔrpoN2/ΔvemR和ΔvemR/ΔfleQ的Biofilm形成能力也明顯減弱，但比ΔvemR單突變體略強(qiáng).Δr poN2、ΔfleQ、Δrpo N2/ΔfleQ和Δr poN2/ΔvemR/Δf l e Q均與野生型結(jié)果相似，氣液界面環(huán)菌落面積較大，結(jié)晶紫染色吸光值較高，具有較強(qiáng)的Biofilm合成能力.以上結(jié)果表明，VemR正調(diào)控Biofilm的生物合成，但RpoN2和FleQ可能拮抗VemR的活性，存在部分上位效應(yīng).

圖3 rpoN2、vemR和fl eQ突變對(duì)Xcc Biofilm含量的影響

2.3 VemR、RpoN2和FleQ對(duì)Xcc胞外蛋白酶的調(diào)控蛋白酶是一類能夠水解蛋白質(zhì)肽鏈的酶.細(xì)菌若能分泌胞外蛋白酶，則能夠在含有2%脫脂奶粉的平板上形成一個(gè)無(wú)色透明的水解圈.如圖4所示，除了ΔvemR/Δf le Q雙突變體外，其余所有突變體的水解圈直徑與WT菌株大小幾乎一致.ΔvemR/ΔfleQ雙突變體的水解圈極小，較野生型菌株降低約64.7%，說(shuō)明其產(chǎn)生蛋白酶的能力明顯減弱.ΔvemR和ΔfleQ單突變體不影響蛋白酶的分泌.以上結(jié)果表明，vemR和fl e Q共同調(diào)控Xcc8004菌株分泌蛋白酶，在功能上有冗余.但RpoN2可抑制VemR和FleQ的活性，可能在VemR和FleQ的信號(hào)下游起作用.

圖4 rpoN2、vemR和fl eQ突變對(duì)Xc c胞外蛋白酶含量的影響

2.4 VemR、RpoN2和FleQ對(duì)Xcc胞外淀粉酶活性的調(diào)控Xcc8004具有淀粉酶活性，因此它能夠在含有0.1%可溶性淀粉的NYG平板上形成透明的水解圈.如圖5所示，與WT型相比，ΔvemR和ΔvemR/Δf l e Q突變體的淀粉酶水解圈直徑明顯變小，分別降低約16.4%和23%.其余突變體分泌淀粉酶的能力與WT型差異不大.這表明VemR正調(diào)控Xcc淀粉酶的合成或分泌，F(xiàn)leQ可協(xié)同VemR調(diào)控胞外淀粉酶活性，但RpoN2具有拮抗VemR和FleQ的功能.因此，VemR和FleQ可能通過(guò)負(fù)調(diào)控RpoN2來(lái)調(diào)控胞外淀粉酶的合成或分泌.

圖5 rpoN2、vemR和fl eQ突變對(duì)Xc c胞外淀粉酶活性的影響

2.5 VemR、RpoN2和FleQ對(duì)Xcc胞外纖維素酶活性的調(diào)控Xcc8004也具有分泌纖維素酶的功能，能夠在含有0.5%的羧甲基纖維素的固體培養(yǎng)基上形成水解纖維素的圈.如圖6所示，所有vemR缺失突變體（即ΔvemR、ΔrpoN2/ΔvemR、ΔvemR/ΔfleQ和Δr poN2/ΔvemR/Δf le Q）的水解圈均比WT菌株小約12%～17%，而ΔrpoN2、Δfl e Q和ΔrpoN2/ΔfleQ突變體的水解圈大小與野生型菌株沒有明顯差異.以上結(jié)果表明，在Xcc8004中，RpoN2和FleQ對(duì)纖維素酶的合成或分泌沒有影響，VemR則正調(diào)控纖維素酶的合成或分泌.

3 討 論

在病原菌中，毒力因子的產(chǎn)生在多個(gè)水平上受到嚴(yán)格調(diào)控.在黃單胞菌中，EPS、Biofilm和胞外酶的表達(dá)主要由Rpf/DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)［23-25］.此外，一些雙組分系統(tǒng)（如RpfC/RpfG、RavA/RavR、HpaS）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clp等也參與其胞外酶和Biofilm等生物合成的調(diào)控［26-28］.除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，全局性轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子RsmA和小RNA伴侶Hfq也影響XccEPS、纖維素酶和淀粉酶的產(chǎn)生［29-30］.

在許多病原菌中，rpoN2-vemR-fleQ操縱子調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)、毒力、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成、細(xì)菌鞭毛的組裝和群體感應(yīng)等［31-35］.在Xcc8004中，我們先前發(fā)現(xiàn)VemR可調(diào)節(jié)EPS的生物合成和細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而影響細(xì)菌的致病力［13］.在這里，我們還發(fā)現(xiàn)VemR正調(diào)控纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的合成或分泌，并且vemR缺失突變后Xcc8004菌株幾乎無(wú)法產(chǎn)生生物被膜.這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明VemR可能是全局性的調(diào)節(jié)因子，影響包括胞外酶、EPS、Biofilm、運(yùn)動(dòng)性在內(nèi)的諸多致病相關(guān)因子的形成，調(diào)控細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力，進(jìn)而影響病原菌的致病力.此外，除纖維素酶外，VemR對(duì)上述致病因子的調(diào)控均依賴于RpoN2和FleQ，暗示vemR操縱子內(nèi)的3個(gè)基因具有上下位效應(yīng)，處于一條信號(hào)傳遞途徑上.由于RpoN2和FleQ均為DNA結(jié)合蛋白，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子起作用，而VemR沒有相關(guān)的功能輸出結(jié)構(gòu)域，因此VemR可能影響RpoN2或FleQ的DNA結(jié)合活性，進(jìn)而調(diào)控致病因子合成或分泌相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控病原菌的致病力，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究.