陳超 王真 任南 劉夢瑤 紀(jì)曉萌 李瑩瑩 郭文萍

摘 要：建立一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉中5-腺苷酸（5-adenosine monophosphate，AMP）、5-肌苷酸（5-inosine monophosphate，IMP）、肌苷（inosine，I）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）的方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果表明：優(yōu)化后的方法為樣品中加入體積分?jǐn)?shù)3%高氯酸-10%甲醇水溶液后添加勻漿均質(zhì)子渦旋，離心，調(diào)節(jié)提取液pH值為5.0后用PEIME HLB柱凈化，采用SB-Aq色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 ?m），流動相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，外標(biāo)法定量;經(jīng)方法學(xué)考察，4 種核苷類成分（AMP、IMP、I、Hx）線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996，加標(biāo)回收率為79.63%～91.08%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～4.5%（n=6）。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);雞肉;正離子多反應(yīng)監(jiān)測;5-腺苷酸;5-肌苷酸;肌苷;次黃嘌呤

Determination of Inosine and Its Related Compounds in Chicken by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Chao， WANG Zhen， REN Nan， LIU Mengyao， JI Xiaomeng， LI Yingying*， GUO Wenping

（China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： This study aimed to set up an analytical method to detect 5-adenosine monophosphate （AMP）， 5-inosine monophosphate （IMP）， inosine （I）， and hypoxanthine （Hx） in chicken by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） and to assess its figures of merit. The results showed that the experimental conditions of this method were optimized as follows： samples were homogenized using a vortex mixer by addition of 3% perchloric acid-10% methanol in water followed by centrifugation， and the supernatant extract was purified with a PEIME HLB cartridge after being adjusted to pH 5.0. The analytes were separated on an SB-Aq column （3.0 mm × 100 mm， 1.8 ?m） using a mobile phase consisting of 0.1% formic acid in water and acetonitrile by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min， detected in the positive ion multiple reaction monitoring （MRM） mode， and quantified by the external standard method. The calibration curves for the four nucleoside components had good linearity with correlation coefficients of greater than 0.996. The spiked recoveries ranged between 79.63% and 91.08%， with relative standard deviations （RSDs） of 1.0%–4.5% （n = 6）.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; chicken; positive ion multiple reaction monitoring mode; 5-adenosine monophosphate; 5-inosine monophosphate;? inosine; hypoxanthine

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210709-185

中圖分類號：TS201.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）10-0041-07

引文格式：

陳超， 王真， 任南， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中肌苷及其關(guān)聯(lián)物[J]. 肉類研究， 2021， 35（10）： 41-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210709-185.? ? http：//www.rlyj.net.cn

CHEN Chao， WANG Zhen， REN Nan， et al. Determination of inosine and its related compounds in chicken by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 41-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210709-185.? ? http：//www.rlyj.net.cn

禽肉是我國主要食用肉類之一，廣受消費者歡迎[1]。

禽肉營養(yǎng)豐富，味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、脂肪、風(fēng)味物質(zhì)等，是人們膳食中不可或缺的重要組成部分[2]。雞肉在燉煮過程中可釋放小肽、游離氨基酸、無機(jī)鹽、核酸代謝物等物質(zhì)，賦予雞湯一定的風(fēng)味，核酸代謝物是燉肉中與鮮味相關(guān)的主要化合物，其中5-肌苷酸（5-inosine monophosphate，IMP）對鮮味貢獻(xiàn)大[3-4]。核苷酸屬于一類有機(jī)化合物，由嘌呤堿基或嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸3 種物質(zhì)組成，五碳糖通過β-糖苷鍵連接，與有機(jī)堿合成核苷，核苷與磷酸合成核苷酸，核苷和核苷酸是胞內(nèi)化合物，參與各種調(diào)節(jié)和代謝功能[5]。動物宰后短時間內(nèi)，組織中ATP含量變化較小，隨著磷酸肌酸的耗盡及糖原酵解停止，ATP合成反應(yīng)停止，開始迅速分解。糖原酵解產(chǎn)生的乳酸及ATP降解產(chǎn)生的磷酸，使肌肉pH值下降，肌肉達(dá)到極限pH值時，大部分ATP降解為5-腺苷酸（5-adenosine monophosphate，AMP），進(jìn)而分解生成IMP、無機(jī)磷酸和氨，IMP進(jìn)一步降解生成肌苷（inosine，I）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）、磷酸和核糖等[6-7]，AMP及其降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

隨著生活質(zhì)量的提高，人們對食品的風(fēng)味、新鮮程度等指標(biāo)開始廣泛關(guān)注。近年來，學(xué)者開始關(guān)注IMP的鮮味貢獻(xiàn)，隨著IMP降解產(chǎn)生Hx，賦予苦味“異味”，Hx的檢測被用于評估食品工業(yè)中魚類的新鮮度。因此無論是研究風(fēng)味還是研究新鮮度，AMP的降解產(chǎn)物及其相互關(guān)系均為肉質(zhì)評定的重要指標(biāo)[8-9]。目前，核苷酸及其關(guān)聯(lián)物的研究多集中在生物性樣品（如血液、尿液）[10-14]、中藥[15]、保健品（如人參、鹿茸）[16-17]、食用菌[18-22]、水產(chǎn)品（如中華絨螯蟹[23]、草魚[24]、對蝦[25-26]、梭子蟹[27]）等，也有學(xué)者研究不同貯藏條件下雞肉IMP的變化規(guī)律[7]，同時測定AMP及其降解產(chǎn)物的研究還鮮有報道。核苷酸及其關(guān)聯(lián)物的研究方法主要有毛細(xì)管電泳法[9，12，28]、生物傳感器法[8，13]、高效液相色譜法[12，25，27]、高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[15，28]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11，14]等，由于雞肉基質(zhì)較為復(fù)雜，為了同時滿足分離度、靈敏度及定量的需求，本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜開發(fā)出一種雞肉中AMP、IMP、I、Hx的高效、簡易的分析方法，為同時測定動物源性食品中多種核苷酸關(guān)聯(lián)物提供思路，為動物源性食品的風(fēng)味和新鮮度指標(biāo)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉購自北京市某連鎖超市，雞胸肉及雞腿肉各200 g，攪碎處理。

IMP（純度100.0%）、AMP（純度100.0%）、Hx（純度99.4%）、乙腈（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司;I（純度98.0%） 上海泰坦科技股份有限公司;甲醇、三氯乙酸、高氯酸（均為優(yōu)級純）?國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜-6470串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀

美國Agilent公司;S-100渦旋儀、SR-Ⅱw振蕩器 日本Taiyo公司;DT1028H超聲波提取儀 德國Bandelin公司;CR21N離心機(jī)? ?日本Hitachi公司;Milli-Q純水儀 美國Millipore公司;ABM-2均質(zhì)機(jī) 株式會社日本精機(jī)制作所。

1.3 方法

1.3.1 提取

雞肉經(jīng)組織研磨儀研磨后，準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入10 mL提取溶劑（分別考察體積分?jǐn)?shù)6%高氯酸、體積分?jǐn)?shù)10%甲醇水溶液、3%高氯酸+10%甲醇水溶液和體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸的提取效果），選用合適的提取方式提取20 min（分別考察勻漿、超聲、振蕩、添加陶瓷均質(zhì)子渦旋4 種提取方式的提取效果），以12 000 r/min離心4 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，于殘渣中再加入10 mL提取溶劑，重復(fù)以上步驟，合并2 次提取溶液，用5.0 mol/L及0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值（分別考察將pH值調(diào)節(jié)至4.5、5.0、5.5、6.0時的效果），待凈化。

1.3.2 凈化

取提取液5 mL至凈化柱（分別考察PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS法、MCX柱3 種凈化方式的效果），收集凈化液于10 mL接收管中，渦旋0.5 min，過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-質(zhì)譜測定。

1.3.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)AMP、IMP、I、Hx各10 mg，分別置于4 個50 mL燒杯中，Hx先用2 mL 0.5 mol/L硫酸溶液促進(jìn)溶解，其他物質(zhì)加適量的一級水溶解，并用一級水轉(zhuǎn)移并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為100 ?g/mL的單標(biāo)儲備液，4 ℃冰箱中避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取各單標(biāo)儲備液適量，用一級水配制成各物質(zhì)質(zhì)量濃度梯度為50、100、200、500、1 000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱：SB-Aq RRHD柱（3.0 mm×100 mm，1.8 ?m）;柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積2 μL;流動相A：甲酸-水溶液（1∶99，V/V）;流動相B：乙腈;流速0.3 mL/min。洗脫梯度見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧（electrospray ionization，ESI）離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓2 800 V，干燥氣流速11 L/min，噴針氣壓力241 kPa（35 psi），離子源溫度270 ℃，鞘氣流速10 L/min，鞘氣溫度300 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測模式參數(shù)見表2。

1.3.5 結(jié)果計算

樣品中4 種化合物含量用下式計算。

式中：X為樣品中目標(biāo)化合物含量/（mg/kg）;C為由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合得到的樣品提取液中目標(biāo)化合物含量/（ng/mL）;V為最終定容體積/mL;n為樣品處理過程中的稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2017軟件;化學(xué)結(jié)構(gòu)式采用Chemsketch軟件繪制;柱狀圖采用Originpro 8.5軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

作為化合物分析的第1步，選擇合適的提取溶劑，將目標(biāo)物從樣品基質(zhì)中高效、快速地提取出來非常重要[29-30]。

本研究選擇體積分?jǐn)?shù)6%高氯酸、體積分?jǐn)?shù)10%甲醇水溶液、3%高氯酸+10%甲醇水溶液和體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸作為提取溶劑，分別考察4 種溶劑的提取效果。由于樣品基質(zhì)本身含有目標(biāo)化合物，采用基質(zhì)曲線，以排除基質(zhì)中所含目標(biāo)物對實驗結(jié)果造成的影響。

對比使用不同提取溶劑、加標(biāo)量為100 ng/mL時的加標(biāo)回收率。由圖2可知，用10%甲醇水溶液作提取溶劑時，IMP、I和Hx的加標(biāo)回收率都在90%以上，但AMP沒有響應(yīng)，這可能是由于AMP含有氨基，需要提供更多的H+使其發(fā)生電離。另外3 種提取溶劑中，使用3%高氯

酸+10%甲醇水溶液時，4 種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率都在85%左右，最高達(dá)到88%。使用6%高氯酸和5%三氯乙酸時，4 種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率均不到80%，因此選用3%高氯酸+10%甲醇水溶液作提取溶劑。

2.2 提取方式的選擇

雞肉中脂肪和蛋白質(zhì)的含量都很高，在提取過程中對化合物的提取效率會有一定影響。選擇合適的提取方式，減小基質(zhì)對于化合物的干擾很有必要。本研究考察常見的4 種提取方式：12 000 r/min轉(zhuǎn)速下勻漿5 min、超聲波提取儀中超聲20 min、振蕩器振蕩30 min、添加陶瓷均質(zhì)子渦旋20 min，由于樣品基質(zhì)本身含有目標(biāo)化合物，采用基質(zhì)曲線，以排除基質(zhì)中所含目標(biāo)物對實驗結(jié)果造成的影響。

對比不同提取方式、加標(biāo)量為100 ng/mL時的加標(biāo)回收率。由圖3可知，通過勻漿提取的效果最差，加標(biāo)回收率為75%左右，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，接近2%。通過振蕩提取的加標(biāo)回收率為80%左右，通過超聲提取的加標(biāo)回收率為85%左右，振蕩和超聲提取的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均約為1%。添加勻漿均質(zhì)子渦旋的提取效果最好，加標(biāo)回收率為90%以上，最高達(dá)93%，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小，約為0.5%，因此提取方法選用添加勻漿均質(zhì)子渦旋。

2.3 提取液最適pH值的選擇

pH值對分析物保留時間和分離效果影響很大，比較不同pH值提取液對目標(biāo)化合物分離的影響。

由圖4可知，當(dāng)提取液pH值為5.5和6.0時，加標(biāo)回收率均在80%以下，當(dāng)提取液pH值為4.5時，加標(biāo)回收率為81%～87%，當(dāng)提取液pH值為5.0時加標(biāo)回收率最高，平均值為91.3%?？赡苁怯捎趐H值影響目標(biāo)物質(zhì)在質(zhì)譜儀中的電離效果，在pH值為5.0時電離最完全，故選取pH 5.0作為提取液的最適pH值。

2.4 凈化方式的選擇

樣品經(jīng)過提取后，上清液中還含有大量油脂，油脂分子質(zhì)量較大，在流動相中流動緩慢，極易堵塞色譜柱，另外油脂和蛋白質(zhì)對4 種目標(biāo)物的檢測產(chǎn)生基質(zhì)干擾，降低方法的靈敏度。為了能有效對雞肉樣品進(jìn)行凈化和富集，除去油脂、蛋白質(zhì)等基質(zhì)干擾，選擇合適的凈化方式也十分有必要。本研究選擇PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS法、MCX柱3 種方式對樣品進(jìn)行凈化。由于樣品基質(zhì)本身含有目標(biāo)化合物，采用基質(zhì)曲線，以排除基質(zhì)中所含目標(biāo)物對實驗結(jié)果造成的影響。

對比不同凈化方式、加標(biāo)量為100 ng/mL時的加標(biāo)回收率。由圖5可知，用QuEChERS法和MCX柱凈化時的加標(biāo)回收率均不到90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～0.9%。用PEIME HLB柱凈化時，平均加標(biāo)回收率達(dá)90%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最高只有0.4%，故選取PEIME HLB柱作為凈化方式。

2.5 色譜條件優(yōu)化

在周俊華等[29]的研究基礎(chǔ)上，選擇乙腈和甲酸水溶液作為流動相，比較Hilic Plus柱、C18柱和SB-Aq柱3 種色譜柱對4 種化合物的分離效果。由圖6可知，由于4 種化合物均為極性化合物，在C18柱上保留較弱，易受到雜質(zhì)的干擾，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)不能達(dá)到有效分離。Hilic柱可以將4 種化合物分離，但分離度不佳、整體響應(yīng)不高。SB-Aq柱可將4 種化合物有效分離且峰形對稱、尖銳，各物質(zhì)分離度及響應(yīng)都較Hilic Plus柱高，因此選用SB-Aq柱作為分析色譜柱?？紤]到樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，在后續(xù)研究中，選擇梯度洗脫來改善分離效果。

2.6 質(zhì)譜條件優(yōu)化

AMP、IMP、I中連接堿基與戊糖的糖苷鍵在酸性條件下不穩(wěn)定，容易斷裂得到帶正電荷的基團(tuán)，在正離子模式下靈敏度較高，因此選取ESI+模式進(jìn)行檢測。

在ESI+模式下，通過直接進(jìn)樣法，優(yōu)化各化合物的質(zhì)譜條件，然后通過全掃描模式，得到化合物[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，以此作為它們的母離子。在此基礎(chǔ)上，通過子離子掃描尋找子離子，選擇2 個豐度較高、本底噪音較低的子離子，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終選定定量分析條件。各化合物的保留時間、母離子、主要碎片離子、最佳碰撞電壓和去簇電壓詳見表2。定性、定量離子流圖見圖7，檢測樣品時，通過質(zhì)譜儀將母離子打碎成相對應(yīng)的子離子，且相對豐度與圖7一致時，則可確定存在此化合物。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

利用逐級稀釋法向樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成AMP、IMP、I、Hx質(zhì)量濃度梯度均為50、100、200、500、1 000 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的前處理和儀器條件下進(jìn)行測定。以3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限。

由表3可知，該方法在50～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，4 種目標(biāo)化合物相關(guān)系數(shù)均大于0.996，AMP檢出限和定量限分別為0.05、0.20 mg/kg，IMP檢出限和定量限分別為0.02、0.10 mg/kg，I和Hx檢出限和定量限均分別為0.03、0.15 mg/kg。

2.7.2 穩(wěn)定性實驗

取2 g雞肉樣品，按照選定的前處理方法進(jìn)行處理，將所得溶液按照選定的儀器方法于放置0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測定。由表4可知，4 種目標(biāo)化合物含量測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～0.8%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3 加標(biāo)回收率和精密度實驗

稱取雞肉樣品6 份，每份2.0 g，向樣品中分別添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)量分別為0.25、1.00、5.00 mg/kg，按照選定的前處理方法和儀器方法進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實驗。

由表5可知，在3 個加標(biāo)水平下，4 種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為79.63%～91.08%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，表明所建立的方法準(zhǔn)確度較好，能滿足雞肉中4 種目標(biāo)化合物含量測定要求。

3 結(jié) 論

建立雞肉中AMP、IMP、I、Hx 4 種化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。在優(yōu)化條件下，4 種化合物得到有效分離，基線平穩(wěn)，穩(wěn)定性好;對樣品進(jìn)行不同水平加標(biāo)實驗，結(jié)果表明，回收率較高，精密度較好。該方法簡便、可靠、實用性強(qiáng)，適合于雞肉中AMP、IMP、I、Hx含量的測定。

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收稿日期：2021-07-09

第一作者簡介：陳超（1986—）（ORCID： 0000-0001-9176-859X），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測。

E-mail： 584686214@qq.com

*通信作者簡介：李瑩瑩（1984—）（ORCID： 0000-0002-9677-0397），女，教授級高級工程師，碩士，研究方向為食品安全與真實性分析。E-mail：? ying_sky@126.com