張迪 張惠嬌 葉劍鵬 王國勝 王建輝 房全黨 李建國△

(1.福建省漳州正興醫(yī)院肝膽胰脾外科，福建 漳州 363000;2.福建省漳州市醫(yī)院婦科,福建 漳州 363000)

肝癌是臨床上常見的肝組織惡性腫瘤，臨床上常采用手術(shù)切除及化療等治療方法，但由于患者病情較為隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時已經(jīng)伴有腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者的生存率降低[1-3]。因此，了解肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制對早期的疾病診斷及治療預(yù)后至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)[4-6]，是類長度大于200bp、無編碼蛋白能力的RNA，在細胞的正常生理和病理過程發(fā)揮著重要作用[7-9]。大量研究證實，異常表達的lncRNA在腫瘤的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10-14]。以往研究證實lncRNA EIF3J-AS1能夠促進結(jié)腸癌細胞的增殖能力并且抑制細胞凋亡[15],但是EIF3J-AS1在肝癌中的作用機制仍然沒有完全闡明，需要進一步探索。本研究旨在探討EIF3J-AS1通過上調(diào)肌動蛋白結(jié)合蛋白(ANLN)促進肝細胞癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機制。

1 材料與方法

1.1人肝癌細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肝癌細胞系Hep3 B、HepG2、Huh7和MHCC-97H以及人正常肝細胞 (L-02)購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，人肝癌細胞細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞株置于37 ℃、CO25%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。lnc EIF3J-AS1干擾慢病毒細胞轉(zhuǎn)染按照文獻報道[16]的方法進行。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同將細胞分為：Ⅰ：陰性對照組(MHCC-97H sh-NC)、lnc EIF3J-AS1敲減組(MHCC-97H sh-EIF3J-AS1)；Ⅱ：陰性對照組(Huh7 sh-NC)、lnc EIF3J-AS1敲減組(Huh7 sh-EIF3J-AS1);Ⅲ：陰性對照組(MHCC-97H sh-NC)、ANLN敲減組(MHCC-97H sh-ANLN)；Ⅳ：陰性對照組(Huh7 sh-NC)、ANLN敲減組(Huh7 sh-ANLN)。通過RTFQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染后分別檢測Ⅰ和Ⅱ組細胞的lnc EIF3J-AS1以及Ⅲ和Ⅳ組的ANLN表達水平，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2組織標本 該研究組織樣本來自于2013年1月-2015年12月之間在福建省漳州正興醫(yī)院肝膽胰脾外科進行手術(shù)切除的97例肝癌患者的腫瘤和對應(yīng)標本的癌旁正常組織。納入本研究的患者均為初診且術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療，排除伴其他惡性腫瘤或有既往惡性腫瘤病史的患者。本項研究通過了福建省漳州正興醫(yī)院倫理委員會批準并取得患者的知情同意，臨床資料見表1。通過電話、郵件、復(fù)查等方式進行隨訪，末次隨訪時間為2018年12月31日。在術(shù)后的前兩年，患者每3個月隨訪一次；術(shù)后3～5年每6個月隨訪一次；術(shù)后5年以后，每年隨訪一次。

1.3RTFQ-PCR實驗 Trizol一步法提取細胞總RNA，后續(xù)實驗操作步驟依照參考文獻進行[16]。RTFQ-PCR在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行，每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔，40個循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參照，應(yīng)用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。具體引物序列如下：EIF3J-AS1-F:AAGTACCAGGCAGTGACAGC；EIF3J-AS1-R:TTCTCCACGTTCTTCTCGGC;ALNL-F:CGACTGCTGATGTAGTAATTT；ANLN-R:CGTCGAATTAAGGCTGATGT；GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT；GAPDH-R:TTGATTTTGGAGGGATCTCG。

1.4蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測 蛋白抽提參照碧云天蛋白抽提試劑盒說明書進行，后續(xù)配膠、電泳、轉(zhuǎn)模、賦予一抗、二抗參照參考文獻[16]，最后根據(jù)ECL試劑盒說明，于暗室中進行顯影。ANLN以及GAPDH均購自美國Abcam公司。

1.5細胞遷移與侵襲實驗 細胞侵襲和遷移實驗步驟參照參考文獻[16]，簡言之，將各處理組肝癌細胞放在胰蛋白酶溶液下進行消化，3 500 r/min條件下離心10 min后，計數(shù)后將細胞濃度調(diào)整至50 000 個/mL。分別將含有Materigel培養(yǎng)基(侵襲實驗)或不含有Materigel培養(yǎng)基(遷移實驗)包被的Transwell上室放入6孔板中，上室添加200μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基細胞懸液，下室添加900 μL含20%血清濃度的DMEM培養(yǎng)基，將含小室的6孔板放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。最終取出Transwell小室加入100%甲醇進行細胞固定，采用0.1%結(jié)晶紫進行1 h的染色，在顯微鏡下拍照并記錄穿膜細胞數(shù)量，染色后拍照計數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS version 24(Chicago,USA)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗、χ2檢驗或Fisher精確概率法對兩組計數(shù)資料進行比較。采用Kaplan-Meier生存分析方法進行估計并且采用Log-rank檢驗方法進行顯著性檢驗。檢驗水準α=0.05。利用單因素和多因素Cox比例風險模型分析影響患者總生存的獨立預(yù)測因子。多因素Cox比例風險模型納入的變量為單因素Cox分析中有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的變量。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA EIF3J-AS1在肝癌患者腫瘤組織中上調(diào)表達 應(yīng)用RTFQ-PCR技術(shù)檢測了lncRNA EIF3J-AS1在91例肝癌患者配對癌和癌旁組織中的表達情況。結(jié)果提示，lncRNA EIF3J-AS1在癌和對應(yīng)的癌旁組織中的相對表達量分別為(0.097±0.006)和(0.062±0.003)；與對應(yīng)的癌旁組織相比，lncRNA EIF3J-AS1在癌組織中上調(diào)表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，P<0.01)。

圖1 RTFQ-PCR檢測lncRNA EIF3J-AS1在肝癌組織中的表達情況

2.2lncRNA EIF3J-AS1的相對表達量與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 根據(jù)lncRNA EIF3J-AS1在91例肝癌患者配癌組織平均表達水平，將91例肝癌患者分為45例lncRNA EIF3J-AS1高表達組和46例lncRNA EIF3J-AS1低表達組。lncRNA EIF3J-AS1的高表達與腫瘤癌栓(P=0.022)、腫瘤大小(P=0.016)顯著相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤數(shù)目、血清病毒復(fù)制程度、腫瘤的分化程度、血清甲胎蛋白、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移不存在統(tǒng)計學(xué)顯著的相關(guān)性，見表1。

表1 lncRNA EIF3J-AS1的表達量與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

2.3lncRNA EIF3J-AS1的相對表達量與肝癌患者總體之間關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析所有患者的中位隨訪時間是32.1個月(95%CI:24.1～40.1)。lncRNA EIF3J-AS1高表達組的中位總生存期是24.6個月(95%CI:19.2～30.0)，其1年、3年、5年的估計總生存率分別是73.3%、46.7%、7.0%。而lncRNA EIF3J-AS1低表達組的中位總生存期是38.6個月(95%CI:31.6～45.6)，其1年、3年、5年的估計總生存率分別是73.9%、35.8%、20.4%。Kaplan-Meier生存曲線圖分析顯示EIF3J-AS1低表達組患者的總生存時間顯著優(yōu)于高表達組患者(P=0.007)，見圖2。 多因素Cox比例風險模型分析顯示血清甲胎蛋白含量(P=0.011)、腫瘤大小(P=0.036)和EIF3J-AS1表達量(P=0.038)是影響肝癌患者總生存的獨立預(yù)測因子，見表2。

圖2 lncRNA EIF3J-AS1表達量與肝癌患者總生存的Kaplan-Meier 生存曲線分析圖

表2 肝癌患者總生存的單因素和多因素Cox比例風險模型分析

2.4敲減lncRNA EIF3J-AS1抑制Huh7和MHCC-97H細胞的侵襲和遷移能力 為了探討lncRNA EIF3J-AS1對肝癌細胞的增殖能力的影響，首先應(yīng)用定量PCR技術(shù)檢測了lncRNA EIF3J-AS1在正常肝細胞(LO2)以及肝癌細胞系(Huh7、MHCC-97H、Hep3B、和HepG2)中的表達，分別為(1.000 ± 0.012)，(6.756 ± 0.761)，(6.467 ± 0.4807)，(4.487 ± 0.509)，以及(3.377 ± 0.482)，結(jié)果表明肝癌細胞系中l(wèi)ncRNAEIF3J-AS1表達高于正常肝細胞表達，差異以統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A,P<0.05)?？紤]lncRNAEIF3J-AS1在肝癌細胞系Huh7和MHCC-97H細胞中相對表達最高，將lncRNA EIF3J-AS1干擾慢病毒轉(zhuǎn)染至Huh7和MHCC-97H細胞中，并采用RTFQ-PCR檢測lncRNA EIF3J-AS1的表達。結(jié)果表明,在陰性對照組(sh-NC)相比，轉(zhuǎn)染EIF3J-AS1干擾慢病毒組EIF3J-AS1在Huh7和MHCC-97H細胞中表達量顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B，P<0.001)。EIF3J-AS1干擾慢病毒轉(zhuǎn)染Huh7和MHCC-97H細胞后，應(yīng)用transwell實驗檢測肝癌細胞的增殖情況，結(jié)果提示，在Huh7和MHCC-97H細胞中，用transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力情況，結(jié)果提示，在Huh7和MHCC-97H細胞中，EIF3J-AS1干擾組的遷移和侵襲能力明顯低于性對照組(Huh7遷移組：sh-NC vs.sh- EIF3J-AS1; MHCC-97H遷移組：sh-NC vs.sh- EIF3J-AS1 ; Huh7侵襲組：sh-NC vs.sh- EIF3J-AS1; MHCC-97H侵襲組：sh-NC vs.sh- EIF3J-AS1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3C 和 D，P<0.05)。

2.5敲減lncRNA EIF3J-AS1表達可抑制ANLN蛋白表達水平 最后探討lncRNA EIF3J-AS1作用Huh7和MHCC-97H細胞中的分子機制，通過在線數(shù)據(jù)庫GAPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)表明EIF3J-AS1與ANLN蛋白在肝癌腫瘤組織中表達正相關(guān)(r=0.31,P=1.2e-0.9，圖4A),提示EIF3J-AS1可能調(diào)控ANLN表達。通過RTFQ-PCR檢測證實ANLN mRNA表達水平在轉(zhuǎn)染EIF3J-AS1干擾慢病毒組的Huh7和MHCC-97H細胞中表達量顯著降低，差距有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B,P<0.05)。蛋白[質(zhì)]印跡法實驗的結(jié)果表明，在Huh7和MHCC-97H細胞中，與陰性對照組相比，EIF3J-AS1干擾慢病毒組ANLN蛋白水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C，P<0.05)。以上結(jié)果證實，在肝癌細胞中，敲減lncRNA EIF3J-AS1表達可抑制ANLN蛋白表達水平。

2.6敲減ANLN抑制Huh7和MHCC-97H細胞的侵襲和遷移能力 最后我們探討ANLN對肝癌細胞的遷徙和侵襲能力的影響，首先將ANLN干擾慢病毒轉(zhuǎn)染至Huh7和MHCC-97H細胞中，并采用RTFQ-PCR檢測ANLN的表達。結(jié)果表明,在陰性對照組(sh-NC)相比，轉(zhuǎn)染ANLN干擾慢病毒組ANLN在Huh7和MHCC-97H細胞中表達量顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A，P<0.001)。ANLN干擾慢病毒轉(zhuǎn)染Huh7和MHCC-97H細胞后，應(yīng)用transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力情況，結(jié)果提示，在Huh7和MHCC-97H細胞中，ANLN干擾組的遷移和侵襲能力明顯低于性對照組(Huh7遷移組：sh-NC vs.sh-ANLN.; MHCC-97H遷移組：sh-NC vs.sh-ANLN ; Huh7侵襲組：sh-NC vs.sh-ANLN; MHCC-97H侵襲組：sh-NC vs.sh-ANLN)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B 和 C，P<0.05)。

3 討 論

在美國，癌癥的總體5年相對存活率超過60%，而肝癌的5年相對存活率只有30%左右[3]。當腫瘤局限于原發(fā)部且只在局部淋巴結(jié)擴散的時候，最有效的治療方法是手術(shù)。但是大多數(shù)肝癌患者在初次診斷時就已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移或被為局部晚期，并不符合手術(shù)切除的條件，這是肝癌總體預(yù)后不良的一個重要原因[2]。因此，關(guān)于尋找新的肝癌治療靶標或預(yù)后生物標志物的研究，對于提高肝癌患者總體生存率和改善其預(yù)后，將具有十分重要的意義。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于 200個核苷酸的單鏈非編碼RNA,在細胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用[]。LncRNA似乎參與癌癥發(fā)展的所有階段，包括腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并且lncRNA的失調(diào)是某些癌癥的主要特征[5]，因此，隨著越來越多的lncRNA的功能被驗證，大量的證據(jù)表明，失調(diào)或突變的lncRNA在各種神經(jīng)變性、心血管疾病、代謝疾病和各種器官癌癥的病因?qū)W及預(yù)后中起重要作用。lncRNA與腫瘤發(fā)生、臨床分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，表明lncRNA具有成為腫瘤標志物的前景。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EIF3J-AS1在肝癌腫瘤組織中上調(diào)表達，與腫瘤癌栓(P=0.022)和腫瘤大小(P=0.016)顯著相關(guān)。我們通過單因素Cox比例風險模型分析發(fā)現(xiàn)，甲胎蛋白含量(P=0.017)、腫瘤分化程度(P=0.035)、腫瘤癌栓(P=0.025)、腫瘤大小(P=0.014) 、遠處轉(zhuǎn)移(P=0.033) 、EIF3J-AS1表達水平(P=0.012)與患者的總生存相關(guān)。進一步將這些變量納入多因素Cox比例風險模型進行分析，發(fā)現(xiàn)EIF3J-AS1表達水平(P=0.038)、甲胎蛋白含量(P=0.011)、以及腫瘤大小(P=0.036)是影響患者總生存的獨立預(yù)測因子。同時，Kaplan-Meier生存分析顯示EIF3J-AS1高表達組患者的總生存顯著差于低表達組患者(P=0.007)，表明EIF3J-AS1在肝癌中可能發(fā)揮著癌基因的作用。功能研究證實，敲減EIF3J-AS1表達可抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力。在本項研究中,為了探索EIF3J-AS1促進肝癌肝癌細胞侵襲和遷移的潛在的分子學(xué)機制，我們應(yīng)用了在線數(shù)據(jù)庫GEPIA分析證實EIF3J-AS1與肌動蛋白結(jié)合蛋白(anillin actin binding protein，ANLN)在肝癌腫瘤組織中正向相關(guān)，定量PCR和蛋白免疫印跡實驗表明在肝癌中ANLN蛋白表達收到EIF3J-AS1的正向調(diào)控。肌動蛋白結(jié)合蛋白在多數(shù)腫瘤中均存在較高表達性[17]，參與著腫瘤細胞的增殖與遷移，已經(jīng)成為新型生物治療的關(guān)鍵點。而ANLN表達在肝癌細胞的發(fā)生發(fā)展中作用機制尚存在爭議，在本研究中我們第一證實EIF3J-AS1可上調(diào)ANLN表達，且敲減ANLN表達可抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，EIF3J-AS1在肝癌中上調(diào)表達表與腫瘤大小和癌栓顯著相關(guān)，是影響總生存預(yù)后的獨立預(yù)測因子。機制方面，EIF3J-AS1通過上調(diào)ANLN表達促進肝癌細胞侵襲和遷移能力。EIF3J-AS1有望成為肝癌臨床治療的一種新的治療靶點。(圖3，4，5見封三)