楊克彬 朱成磊 高志民

(國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)研究所 國家林業(yè)和草原局/北京市竹藤科學(xué)與技術(shù)重點開放實驗室北京 100102)

漆酶(LAC) 屬于多酚氧化酶，在細(xì)胞壁形成、逆境脅迫、花青素形成和酚類物質(zhì)催化等過程中均發(fā)揮著重要作用[1－2]。高等植物的漆酶多數(shù)存在于木質(zhì)化程度較高的組織中，在植物葉和新芽處也有發(fā)現(xiàn)[3]。研究表明，擬南芥(Arabidopsis thaliana) 17 個漆酶被劃分為6 個亞族[4]，多數(shù)漆酶基因?qū)儆诮M成型表達(dá)，只有LAC7在根毛中特異表達(dá)[5]。同時，漆酶基因的表達(dá)本身又受到miRNA 和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。如在落葉松(Larix gmelinii) 體胚中miR397 通過調(diào)控靶基因漆酶基因來參與細(xì)胞壁的加厚和木質(zhì)化過程[6]；柑橘(Citrus sinensis) 中miR397a 能夠通過調(diào)控LAC4和LAC17在應(yīng)對硼脅迫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]；過量表達(dá)miR397a 的番茄 (Solanum lycopersicum) 中靶基因LeLACmiR397a下調(diào)，引起多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD) 和過氧化物酶(POD) 活性降低[8]。轉(zhuǎn)錄因子MYB58能夠直接激活漆酶基因LAC4，來調(diào)控次生壁的形成[9]。另外，漆酶基因的表達(dá)還受到環(huán)境的影響，如脫落酸 (ABA) 能誘導(dǎo)擬南芥AtLAC4的表達(dá)[10]、外界硼脅迫能提高枳(Poncirus trifoliata)中LAC7的表達(dá)量[11]。

近年來，隨著中國天然林的全面禁伐，木材供給短缺問題更為明顯，因此木本竹的開發(fā)利用更成為研究的熱點。竹材用途廣泛，涉及家具、建筑、造紙等各個方面，其中竹漿造紙具有原料易得、成紙光滑等優(yōu)點，在一定程度上可代替部分木漿造紙。然而，在造紙過程中木質(zhì)素的降解一直是竹漿造紙工業(yè)實現(xiàn)綠色環(huán)保的難點之一，利用生物工程手段來調(diào)控竹子木質(zhì)素生物合成將是解決該問題的重要途徑。目前，雖然對竹子木質(zhì)素生物合成酶基因已有報道，如PePAL[12]、C4H[13]、C3H[14]，但對漆酶基因的研究卻鮮有報道。前期本實驗室從毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了一個miR397的靶基因PeLAC，并通過RLM-5′RACE 的方法驗證了miR397對PeLAC的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)系，分析了PeLAC的組織表達(dá)特性及在不同脅迫處理條件下的表達(dá)特性[15]，但尚缺乏全基因組水平的全面了解。本文借助新版本毛竹基因組[16]，系統(tǒng)分析了42 個漆酶基因的啟動子序列，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究了基因的表達(dá)模式，克隆了啟動子序列PeLACp，并構(gòu)建了瞬時表達(dá)載體，在模式植物擬南芥中研究其表達(dá)模式，以期為深入研究漆酶基因的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 毛竹漆酶基因啟動子序列獲取與順式作用元件預(yù)測

在毛竹新版本基因組數(shù)據(jù)中共鑒定了具有編碼完整保守結(jié)構(gòu)域的漆酶基因43 個[17]，因其中1個沒有啟動子序列信息，所以分別獲取了42 個PeLACs 的起始位點上游序列(2 000 bp) 作為啟動子，應(yīng)用在線軟件PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/) 分析預(yù)測每個基因啟動子中所包含的順式調(diào)控元件，并統(tǒng)計做圖。

1.2 不同處理毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得與漆酶基因表達(dá)模式分析

通過文獻(xiàn)查詢，從發(fā)表論文提交到NCBI 公共數(shù)據(jù)庫的Short Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) 中獲取毛竹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括經(jīng)100 μmol/L 赤霉素(GA3) 溶液處理4 h 的2 個月毛竹幼苗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) (SRR6131113～SRR6131118)[18]，經(jīng)低溫和干旱處理2 h 和8 h 的2年生毛竹實生苗葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRR4450542～SRR4450551)[19]，以及本實驗室的不同長度根和不同高度筍的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[16]。根據(jù)PeLACs 編號從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出其FPKM，采用Log2FPKM 代表基因表達(dá)量，并用TBtools 做圖[20]。

1.3 啟動子序列克隆與測序

以毛竹(P.edulis) 葉片為材料，采用CTAB法基因組DNA 提取[21]。根據(jù)毛竹組數(shù)據(jù)庫(http://www.bamboogdb.org/) 中漆酶基因PeLAC20(PH02Gene23801) 的啟動子序列PeLACp設(shè)計引物，以基因組DNA 為模板，用LAC410-pro-F 與LAC410-pro-R 擴(kuò)增漆酶基因啟動子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM T-easy 載體，送生工生物工程(上海) 股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 啟動子瞬時表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)PeLACp序列以及植物表達(dá)載體pBI101的多克隆位點設(shè)計添加酶切位點的引物L(fēng)AC410-pro-F1 與LAC410-pro-R1 (表1)。以測序正確的PeLACp質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有酶切位點和啟動子序列的片段，用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切將啟動子連接到植物表達(dá)載體pBI101 的多克隆位點，形成PeLACp∶∶GUS融合的表達(dá)載體。

表1 引物序列表Tab.1 List of primer sequences

1.5 基因啟動子的瞬時表達(dá)

將構(gòu)建正確的漆酶基因啟動子與GUS基因融合的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入GV3101 中，用陽性菌株通過浸花法[22]轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥(Col-0)，用卡那霉素(Kan，50 μg/mL) 對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性篩選。啟動子活性分析:在室溫條件下將野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因陽性植株幼苗分別浸泡在GUS 染色液中1 h 或過夜；用70%乙醇脫色至陰性對照為白色；觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果和分析

2.1 毛竹漆酶基因啟動子序列分析

啟動子中分布的順式作用元件在植物生長發(fā)育及響應(yīng)外界環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要的作用，使基因的表達(dá)受到激活或抑制，因此啟動子對于研究基因功能具有重要價值。對42 個PeLACs 啟動子分析結(jié)果表明，根據(jù)順式作用元件的功能主要分為3 個類型，即與激素響應(yīng)相關(guān)、環(huán)境脅迫相關(guān)以及發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，分別包括9種、7 種和4 種順式作用元件(圖1)。在激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件中，脫落酸響應(yīng)元件(ABRE) 最多，存在于40 個PeLACs 的啟動子中，其次是茉莉酸甲酯 (MeJA) 響應(yīng)元件(CGTCA-motif 和TGACG-motif) 共存在于35 個PeLACs 的啟動子中。還中鑒定了GA 響應(yīng)元件(GARE-motif、P-box 和TATC-box) 和生長素響應(yīng)元件(AuxRE、AuxRR-core 和TGA-element)，但是它們僅存在于較少PeLACs 的啟動子中，如AuxRE 僅有1 個存在于PeLAC25 的啟動子中(圖1)。

在環(huán)境脅迫反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件中，參與環(huán)境適應(yīng)性的順式作用元件MYB 和MYC 存在于所有PeLACs 的啟動子中；其次是與厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件(ARE) 存在于32 個PeLACs的啟動子中；與干旱相關(guān)的MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(MBS) 以及低溫響應(yīng)順式作用元件(LTR)分別存在于30 個和24 個PeLACs 的啟動子中；還有低氧特異增強(qiáng)元件(GC-motif)、防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)，但TC-rich repeats 的數(shù)量最少，僅存在于10 個PeLACs 的啟動子中，每個啟動子中僅有1 個(圖1)。

與前2 類相比，與生長發(fā)育過程相關(guān)的順式作用元件的種類和數(shù)量均相對較少。其中參與分生組織生長的CAT-box 最多，存在于27 個PeLACs 的啟動子中，而與胚乳發(fā)育及種子發(fā)育相關(guān)的順式作用元件O2-site 和RY-element 分別存在于13 個和14 個PeLACs 的啟動子中，GCN4_ motif最少僅存在于7 個PeLACs 的啟動子中(圖1)。

圖1 PeLACs 啟動子中與激素響應(yīng)、環(huán)境脅迫及發(fā)育相關(guān)的順式作用元件Fig.1 The cis-acting elements related to hormone response，environmental stress and development in the promoters of PeLACs

另外，在PeLACs 的啟動子中還存在大量的光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，其中最多的是G-box，其次是Box 4。這些結(jié)果表明，PeLACs 的表達(dá)受到多種植物激素和逆境脅迫的影響，啟動子可能通過對不同植物激素和逆境脅迫做出應(yīng)答，來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而使毛竹適應(yīng)相應(yīng)的生長環(huán)境。

2.2 不同處理下PeLACs 的表達(dá)分析

在不同漆酶基因啟動子中不同順式作用元件的存在，表明它們可能對不同激素以及非生物脅迫具有不同的響應(yīng)機(jī)制。因此，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了不同處理條件下42 個基因PeLACs的表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，經(jīng)過GA3處理4 h后，14 個PeLACs 顯著變化，其中11 個PeLACs下調(diào)和3 個PeLACs 上調(diào)，其余基因的變化均未超過2 倍(圖2A)，變化不顯著。在低溫和干旱處理的毛竹葉片中，能檢測到大部分PeLACs的表達(dá)，但有12 個PeLACs (低溫) 和14 個PeLACs (干旱) 檢測不到表達(dá)(FPKM ＝0) 或幾乎不表達(dá)(FPKM<1) (圖2B，C)。與處理前相比(0 h)，隨著低溫脅迫時間的延長，6 個PeLACs 表達(dá)持續(xù)上調(diào)，而其余基因則呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)或先升高后下降的趨勢(圖2B)，在干旱脅迫下檢測到表達(dá)的基因也表現(xiàn)出相似趨勢(圖2C)。在GA3處理以及低溫和干旱脅迫下PeLACs 的表達(dá)差異表明，它們在應(yīng)對激素和非生物脅迫過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

圖2 不同處理條件下毛竹中PeLACs 的表達(dá)模式Fig.2 Expression profiles of PeLACs in moso bamboo under different treatments

2.3 不同長度根和不同高度筍中PeLACs 的表達(dá)分析

漆酶是木質(zhì)素生物合成單體聚合的關(guān)鍵酶，在竹子木質(zhì)化中發(fā)揮著重要作用。為此，對毛竹不同高度筍中的PeLACs 表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在不同生長階段的根和筍中PeLACs 的表達(dá)模式存在著一定的差異，其中16 個PeLACs 在根和筍中表達(dá)水平較高且存在類似的變化趨勢。隨著根長的增加(根生長)，表達(dá)量上調(diào)，具體表現(xiàn)為2 種變化模式，即持續(xù)上調(diào)和先升高后下降(圖3)。另外，這些基因在筍中表達(dá)也表現(xiàn)出相似的變化趨勢，即隨著筍高度的增加，它們的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢，同樣也存在2 種變化模式。有趣的是，這些基因在0.2 m 筍中不表達(dá)或者表達(dá)量極低；在1.5 m 和3.0 m 高度筍中的中部和基部高表達(dá)，但在尖部表達(dá)量極低；但是在6.7 m 筍則尖部和中部的表達(dá)水平高，而基部反而較低。這些PeLACs 表達(dá)的變化與竹筍、根的木質(zhì)化過程的變化趨勢高度吻合，說明這些基因參與到筍和根的木質(zhì)化過程[16]。

圖3 PeLACs 在毛竹根和筍中的表達(dá)Fig.3 Expression of PeLACs in roots and shoots of moso bamboo

2.4 PeLAC20 啟動子克隆與瞬時表達(dá)構(gòu)建

用引物L(fēng)AC-pro-F 與LAC-pro-R 進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，獲得了約2.0 kb 的特異條帶(圖4A)，連接到pGEM T-easy 載體后測序結(jié)果表明，插入片段為2 000 bp。用引物L(fēng)AC410-pro-F1 與LAC410-pro-R1 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了約2.0 kb 的特異條帶，測序結(jié)果表明，包含PeLAC20上游PeLACp序列2 000 bp 以及添加的XbaⅠ(tctaga) 和BamHⅠ(ggatcc) 酶切位點序列 (共計12 bp)，將目的片段與載體pBI101 進(jìn)行連接，得到PeLACp與GUS融合的表達(dá)載體(圖4B)，經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后驗證(圖4C) 和測序后，證明獲得了正確的瞬時表達(dá)載體。

圖4 啟動子PeLACp 克隆與瞬時表達(dá)構(gòu)建Fig.4 The promoter isolation of PeLACp and its transient expression vector construction

2.5 PeLAC20 啟動子在擬南芥中瞬時表達(dá)

轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)Kan 抗性篩選獲得了轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)行GUS 染色分析，結(jié)果顯示PeLACp∶∶GUS轉(zhuǎn)基因植株的根部和子葉緣處被染成藍(lán)色，且根的染色較深(圖5A)，而野生型擬南芥沒有染上藍(lán)色(圖5B)。由此表明，PeLACp具有啟動子活性，而且該基因的表達(dá)在不同組織中存在一定的差異，這可能與該基因的功能密切相關(guān)。如在木質(zhì)化程度較高的根部表達(dá)，可能與PeLAC20參與木質(zhì)素的合成有關(guān)。

3 討論

基因表達(dá)由啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子和控制其時間和空間活動的增強(qiáng)子調(diào)節(jié)[23]?；蜣D(zhuǎn)錄的精確和準(zhǔn)確調(diào)節(jié)主要取決于啟動子，它們在基因組內(nèi)和基因組之間變化很大，一些啟動子富含特定類型的堿基，而其他啟動子則具有更多樣、復(fù)雜的序列特征[24]。啟動子的特性最初是通過能增加或降低基因轉(zhuǎn)錄速率的突變而鑒定的。啟動子一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，被RNA 聚合酶識別并結(jié)合后，開始影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響基因的功能。漆酶基因是竹子木質(zhì)素生物合成中木質(zhì)素單體聚合的關(guān)鍵基因，對木質(zhì)素的沉積具有重要作用[17]，也是影響細(xì)胞壁組分的重要因素，進(jìn)而影響竹材材性。本研究全面分析了42 個PeLACs 的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)其中含有多種與激素以及非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，在不同處理下的毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中漆酶基因的表達(dá)模式進(jìn)一步證明了PeLACs 的表達(dá)受到GA3處理、低溫和干旱脅迫等的影響，同時也表明各漆酶基因在功能上存在一定的差異。

目前從分子水平對漆酶的研究已逐漸成為熱點，并進(jìn)入基因工程階段，如在過量表達(dá)棉花GaLAC1的新疆楊轉(zhuǎn)基因植株中總木質(zhì)素含量增加[25]、敲除美洲黑楊的漆酶基因?qū)е录?xì)胞壁化學(xué)改變及糖釋放增加[26]。本研究中PeLACs 在不同長度根和不同高度筍中的表達(dá)模式，表明PeLACs與毛竹木質(zhì)化中發(fā)揮著重要作用，為竹子基因工程后續(xù)基因的選擇提供了參考。同時，很多重要的漆酶基因被克隆并采用重組技術(shù)研究其同源表達(dá)、異源表達(dá)及調(diào)控機(jī)制[27]。合成啟動子對于基于基因工程的作物改良策略至關(guān)重要，利用源自繁縷(Stellaria mediaVill.) pro-SmAMP1 和pro-SmAMP2 啟動子，合成的一種新的合成啟動子，在瞬時表達(dá)和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞選擇方面都具有高效性[28]。然而，從漆酶基因啟動子入手研究其功能卻鮮有報道，本研究通過瞬時表達(dá)，表明基因啟動子主要在根中表達(dá)，該基因具有組織表達(dá)特異性，對于進(jìn)一步開發(fā)漆酶基因特異表達(dá)啟動子具有重要參考價值。但是，竹子分子生物學(xué)研究整體起步較晚，尚有更多的研究工作需要深入開展。