楊梯豐，張子怡，董景芳，周 煉，張少紅，劉 斌，趙均良

（廣東省農業(yè)科學院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術重點實驗室/廣東省水稻工程實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】隨著我國經濟快速發(fā)展，農村主要勞動力向城市轉移，勞動力短缺已成為水稻生產的突出問題。采取輕簡化、機械化的生產方式，是解決這一問題的根本出路。直播是一種輕簡、高效的栽培模式，近年來發(fā)展迅猛。在雙季稻地區(qū)，強的低溫發(fā)芽力是保證早季直播水稻形成整齊、健壯秧苗的關鍵因素之一。但目前許多主栽水稻品種低溫發(fā)芽力低［1］，已經成為限制直播稻發(fā)展的關鍵 因素。選育耐低溫發(fā)芽力強的水稻品種是推動水稻直播發(fā)展的關鍵。但水稻低溫發(fā)芽力是多基因控制的數量性狀［2］，直接選擇的效率很低，應用常規(guī)遺傳育種技術難以進行有效育種。在水稻中挖掘低溫發(fā)芽力優(yōu)異基因并加以應用，將是水稻低溫發(fā)芽力育種取得突破的關鍵。近年來，分子標記輔助選擇已經被廣泛應用到水稻育種中［3-8］。相比基因的連鎖標記，位于基因內的分子標記可以有效避免遺傳累贅，使目標基因的選擇更高效、準確。因此，基因內分子標記的應用可提高選擇的準確性，從而加快分子育種進程。

【前人研究進展】分子標記技術的發(fā)展為水稻低溫發(fā)芽力的遺傳基礎解析提供了一種有效工具。自分子標記技術發(fā)展以來，國內外對水稻低溫發(fā)芽力QTL 的標記定位已有一些報道。國內學者最早以典型的秈粳交（窄葉青8 號/京系17）的DH 群體為材料，用15 ℃低溫處理種子16 d，鑒定到2 個低溫發(fā)芽力QTL（qLTG9和qLTG4），其貢獻率分別為11.1%和12.6%［9］。隨著分子標記技術的成熟，利用雙親遺傳作圖群體對水稻低溫發(fā)芽力的遺傳解析逐漸增多［10-28］。近年來，全基因組關聯(lián)分析（GWAS）作為一種高效的水稻QTL 鑒定方法，也被應用于水稻低溫發(fā)芽力的定位中［29-36］。目前，通過雙親作圖群體標記定位的水稻低溫發(fā)芽力QTL 已超過110 個，通過GWAS 分析檢測到與低溫發(fā)芽力相關的位點多達174 個，這些 QTL 分布在水稻 12 條染色體上，其中2 個已被克隆，分別是qLTG3-1［37］和OsSAP16［38］。

qLTG3-1是最早被克隆的低溫發(fā)芽力QTL，其功能基因Os03g0103300編碼一個由184 個氨基酸組成的功能未知蛋白。在品系“Hayamasari”中該基因編碼區(qū)71 bp 的缺失是導致低溫發(fā)芽力出現差異的原因［37］。通過對62 份日本水稻核心種質中1 735 bp 的qLTG3-1區(qū)域測序比較，發(fā)現在編碼區(qū)有1 個非同義替換（T/A）以及3 個插入缺失（18 bp 和9 bp 缺失，9 bp 或36 bp 插入），共有10 種等位基因，但在62 份水稻種質中未發(fā)現71 bp 缺失的變異類型［39］。最近，Shim 等［40］通過對2 個有低溫發(fā)芽力差異的品種進行序列分析發(fā)現，在qLTG3-1基因的編碼區(qū)存在3 處可導致氨基酸變異的差異（核苷酸替換變異T/A、CGG/TTC 和18 bp 缺失），并針對這3 處變異設計了引物對98 份亞洲栽培稻的基因型進行分析，根據這3 處編碼區(qū)的變異以及71 bp 的序列缺失，將該基因劃分為5 種單倍型。

【本研究切入點】Shim 等［40］發(fā)現18 bp 缺失（GGCGGTGGCGGTGGCGGT）以 及CGG/TTC變異與低溫發(fā)芽力顯著相關，帶有18 bp 缺失的qLTG3-1有較強的低溫發(fā)芽力。本項目組在對單片段代換系文庫親本的低溫發(fā)芽力評價時發(fā)現，南洋占的低溫發(fā)芽力顯著強于華粳秈74［41］；通過比較這兩份品種的基因組重測序信息發(fā)現，南洋占帶有在編碼區(qū)+127 位無18 bp 缺失的qLTG3-1，而華粳秈74 帶有在編碼區(qū)+127 位有18 bp 缺失的qLTG3-1。闡明“18 bp 缺失能否標示qLTG3-1的低溫發(fā)芽力強弱”這個問題，將為在水稻中利用qLTG3-1開展低溫發(fā)芽力的分子育種提供借鑒?！緮M解決的關鍵問題】雖然Shim等［40］根據測序結果，設計了擴增qLTG3-1中編碼區(qū)+127 位18 bp 差異的引物，但是用這對引物對試驗材料進行擴增，出現了3 種擴增帶型，序列分析顯示第3 種帶型是因為其所用的5 個秈稻品種既含有18 bp 缺失，又增加了36 bp 插入，而36 bp 插入可能是秈稻中的一個特殊變異?？梢?，該引物無法特異區(qū)分該區(qū)域的18 bp 變異。因此，需要設計特異擴增這18 bp 變異的分子標記來進行基因型和低溫發(fā)芽力表型對應關系的分析。本研究設計了可以特異檢測qLTG3-1中這18 bp 變異的分子標記Gltg3-1，并對該標記在華南秈稻的檢測效果進行了評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1單片段代換系及親本 供體親本南洋占、受體親本華粳秈74（秈稻）以及含有南洋占qLTG3-1的單片段代換系1037 由廣東省植物分子育種重點實驗室提供［42］。單片段代換系是通過多代回交以及分子標記輔助選擇創(chuàng)制的一種特殊遺傳材料。它與受體親本之間只存在1 個已知代換片段的差異，所有單片段代換系與受體親本之間可遺傳的表型差異都與這個代換片段相關［43］。單片段代換系1037 帶有來源于南洋占的第3 染色體的代換片段，代換區(qū)間為：短臂末端--RM14259-RM14312-RM14380-RM14427--RM175（0～3.8 Mb）。南洋占、華粳秈74 的qLTG3-1部分序列差異見圖1。

圖1 南洋占、華粳秈74 的qLTG3-1 部分序列差異Fig.1 Partial sequence variations of qLTG3-1 in Nanyangzhan and Huajingxian74

1.1.2秈稻品種/系 以111 份國內秈稻品種/系為研究材料（表1），2019 年晚季種植于廣東省農業(yè)科學院大豐試驗基地，7 月23 日播種，8月8 日移栽，每個品種/系種植4 行，每行8 株，株行距為19.8 cm× 19.8 cm，采用常規(guī)栽培和水肥管理。種子成熟后，按株系收獲種子，曬干，室溫存儲3 個月后用于低溫發(fā)芽力評鑒。

表1 111 份華南秈稻品種/系Table 1 111 indica varieties/lines from South China

1.2 試驗方法

1.2.1低溫發(fā)芽力評價 參照Yang 等［36］的方法，略作修改。每個水稻品種/系取240 粒飽滿的種子置恒溫箱內，49 ℃處理96 h 以打破休眠。用3%次氯酸鈉消毒20 min，蒸餾水沖洗干凈，每80 粒種子排列于1 個鋪有濾紙的9.0 cm 培養(yǎng)皿內，加入 12 mL 蒸餾水，置于15 ℃生長箱中進行低溫發(fā)芽試驗，設置3 個重復。以芽長或根長≥1 mm為萌發(fā)標準，在萌發(fā)10 d 時檢測種子的發(fā)芽率，然后調整溫度為26 ℃，4 d 后再次調查各品種/系的發(fā)芽率，以低溫發(fā)芽力作為種子低溫發(fā)芽的指標。

1.2.2總DNA 提取 DNA 的微量抽提采用TPS法［44］。具體過程如下：于分蘗盛期取上部長約2～4 cm 的葉片放入2 mL 離心管中，加入鋼珠及800 μL TPS（100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、1 mol/L KCL）抽提液，用研磨儀震蕩研磨，然后將其放入75 ℃水浴鍋中水浴20 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液約500 μL 于1.5 mL 離心管中，加入等體積的冰乙醇至DNA 析出，12 000 r/min 離心10 min，去上清，取沉淀，晾干，加滅菌雙蒸水200 μL 至沉淀溶解。

1.2.3引物設計 針對qLTG3-1的18 bp 缺失，從RAP-DB（https://rapdb.dna.affrc.go.jp/）下載以日本晴為參考基因組的Os03g0103300序列。找到目標變異位點，截取上下游各250 bp 序列，用Primer Premier 5 軟件設計引物，并通過NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的Primerblast 進行引物特異性檢測，選取特異性好的引物。

1.2.4PCR擴增和電泳檢測 PCR擴增參照Yang等［6］的方法。15 μL反應體系中包含0.15 μmol/L引物、200 μmol/L dNTP、1×PCR反應緩沖液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl、pH8.3，1.5 mmol/L MgCl2，0.01%明膠）、50～100 ng DNA模板、1UTaq酶。PCR反應在9700型DNA擴增儀中進行，反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴增產物用8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司）檢測帶型。

2 結果與分析

2.1 不同qLTG3-1 等位基因水稻的低溫發(fā)芽力比較

為檢驗南洋占帶有的qLTG3-1能否提升水稻的低溫發(fā)芽力，從單片段代換系庫中選取以華粳秈74 為遺傳背景，對攜帶來源于南洋占qLTG3-1的單片段代換系1037（代換片段為第3 染色體短臂端0～3.8 Mb 區(qū)間）以及南洋占進行低溫發(fā)芽力評價。結果（圖2）表明，單片段代換系1037的低溫發(fā)芽力顯著高于華粳秈74，而南洋占的低溫發(fā)芽力顯著高于1037。可見，來源于南洋占的qLTG3-1能顯著提高華粳秈74 的低溫發(fā)芽力。

圖2 來源于南洋占的qLTG3-1 對水稻低溫發(fā)芽力的影響Fig.2 Effect of qLTG3-1 from Nanyangzhan on low temperature germinability in rice

2.2 qLTG3-1 基因內分子標記的開發(fā)

從RAP-DB 網站下載日本晴的Os03g0103300序列信息。根據文獻［39-40］，在缺失18 bp 序列（GGCGGTGGCGGTGGCGGT）的位置兩側，設計出特異性較好的可擴增該區(qū)域的分子標記Gltg3-1 和Gltg3-2（表2）。預測對沒有18 bp 缺失的序列，分別可擴增出147、247 bp 的片段（R帶型）；而對存在18 bp 缺失的序列，則擴增出129、229 bp 的片段（D 帶型）。

表2 兩對引物的序列和擴增產物信息Table 2 Sequences and amplification products of two pairs of primers

2.3 分子標記的篩選

利用Gltg3-1 和Gltg3-2 引物，隨機選取30 份秈稻（材料編號1～30，表1）進行擴增。Gltg3-1 擴增出兩種帶型，即存在和不存在18 bp缺失的帶型；而 Gltg3-2 擴增出4 種帶型（圖3）。這可能是由于Gltg3-2 擴增區(qū)間較大，在擴增區(qū)間內還存在其他序列變異［39］?？梢?，Gltg3-1 能特異區(qū)分qLTG3-1的18 bp 差異。

圖3 Gltg3-1 和Gltg3-2 標記的擴增帶型Fig.3 Amplification band patterns of two molecular markers（Gltg3-1 and Gltg3-2）

2.4 Gltg3-1 標記對華南秈稻qLTG3-1 的檢測效果

利用分子標記Gltg3-1 對111 份秈稻DNA 進行擴增分型，結果顯示，51 份含有18 bp 缺失（D帶型），53 份無18 bp 缺失（R 帶型），7 份為雜合型（圖4A）。

對qLTG3-1純合的品種/系進行低溫發(fā)芽力測定，在51 份D 帶型的品種/系中，4 份發(fā)芽力低于30.0%，其余47 份品種/系的發(fā)芽力為38.1%～97.5%，平均值為74.0%；在53 份R帶型的品種/系中，2 份發(fā)芽力低于30%，其余51 份品種/系的發(fā)芽力為49.4%～95.7%，平均值為79.0%；但兩組低溫發(fā)芽力差異不顯著（圖4B）。結果表明，該分子標記能區(qū)分存在18 bp 缺失和無18 bp 缺失的qLTG3-1，但是這種帶型差異在華南秈稻中與低溫發(fā)芽力強弱無對應關系。

圖4 Gltg3-1 標記的擴增帶型（A）及不同擴增帶型品種/系的低溫發(fā)芽力（B）Fig.4 Band patterns amplified by molecular marker Gltg3-1 and low temperature germinability of varieties/lines with different band patterns

3 討論

qLTG3-1是控制水稻的低溫發(fā)芽力的QTL［37］；在Hwaseong/IRGC105491 構建的近等基因系群體中也發(fā)現qLTG3-1控制水稻的低溫發(fā)芽力，而且與QTLqLTG1無顯著互作，帶有這兩個QTL 的株系低溫發(fā)芽力顯著高于只帶有單個QTL的株系［40］。在本研究中，帶有來源于南洋占的qLTG3-1能顯著提高華粳秈74 的低溫發(fā)芽力?？梢姡琿LTG3-1是1 個控制水稻低溫發(fā)芽力的重要QTL。

在找到功能基因后確定其功能位點將大大提升該基因在分子育種中的利用效率。已有的等位基因分析表明，qLTG3-1存在多種復等位基因［39-40］。在本研究中，通過比較南洋占和華粳秈74 的qLTG3-1發(fā)現，在編碼區(qū)有18 bp 缺失以及2 bp插入，但是沒有檢測到其他變異位點。可見，qLTG3-1的序列變異豐富，存在多種類型的等位基因。在這些序列變異中，+127 位的18 bp 缺失在多個研究試驗中都存在，可見這個變異在水稻種質中廣泛存在。

為了探究這18 bp 變異是否與低溫發(fā)芽力表型顯著相關，本研究設計分子標記Gltg3-1 特異擴增該位點，通過擴增帶型將品種/系分組進行低溫發(fā)芽力差異分析，結果發(fā)現兩組的低溫發(fā)芽力無顯著差異，即qLTG3-1的18 bp 變異并不能標示低溫發(fā)芽力的強弱。這一結果與Shim 等［40］的結論不一致，可能的主要原因：一是因為Shim等進行低溫發(fā)芽力表型鑒定的材料是韓國的核心稻種，大部分為粳稻，所有出現18 bp 缺失帶型的都是秈稻（含2 份aus 稻），共27 份；而無缺失帶型的都是粳稻，共42 份；而本研究所用的111 份試材均是華南稻區(qū)的秈稻，擴增帶型顯示華南秈稻中也廣泛存在這18 bp 變異，其中51 份為缺失帶型，53 份為無缺失帶型?；谟邢薜脑囼灢牧系玫降慕Y果有一定局限性。二是由于水稻的低溫發(fā)芽力是多基因控制的復雜性狀，還有一些重要的低溫發(fā)芽力QTL 在發(fā)揮作用。從文獻報道的QTL 定位結果來看，通過作圖群體定位到大量的低溫發(fā)芽力QTL，絕大多數QTL 都位于不同的染色體區(qū)間［9-35］?？梢?，在不同遺傳材料中，往往存在多個控制低溫發(fā)芽力的QTL，QTL 位置一般并不相同，單個QTL 的效應比較小。在本研究中，單片段代換系1037 的低溫發(fā)芽力顯著高于華粳秈74，而南洋占的低溫發(fā)芽力顯著高于1037?？梢姡谀涎笳贾幸泊嬖诙鄠€控制低溫發(fā)芽力的QTL。

在Shim 等［40］研究中，來源于O.ruf ipogon缺失了18 bp 的qLTG3-1等位基因能顯著增強低溫發(fā)芽力；在本研究中，來源于南洋占帶有無缺失的qLTG3-1能顯著增強低溫發(fā)芽力。這進一步證實，qLTG3-1的18 bp 變異無法區(qū)分低溫發(fā)芽力的高低。因此，在水稻低溫發(fā)芽力改良中，需要對qLTG3-1等位基因的效應進行評價，獲得增強水稻低溫發(fā)芽力的等位基因用于品種改良。在本研究中，鑒定到來源于南洋占的qLTG3-1能顯著提高華粳秈74 的低溫發(fā)芽力，該等位基因可用于提高水稻低溫發(fā)芽力的改良。

分子標記輔助選擇育種是利用與目標QTL緊密連鎖或者來自目標基因內部的分子標記，對雜交后代的基因型進行準確判別，進而輔助選擇目標性狀。它不受外界環(huán)境的干擾，能顯著提高育種效率，已成為水稻遺傳改良的重要工具。開發(fā)簡便、經濟和實用的分子標記是高效開展水稻分子標記輔助選擇育種的基礎。本研究依據在qLTG3-1復等位基因中廣泛存在的18 bp 變異設計了分子標記Gltg3-1，該分子標記存在于基因內部，可以高效準確地在雜交后代中選擇到目標基因，這將在水稻低溫發(fā)芽力分子育種中發(fā)揮作用。

本研究僅對在qLTG3-1中廣泛存在的18 bp變異與低溫發(fā)芽力表型的關系進行分析，但已有研究表明，qLTG3-1中存在豐富的序列變異［39-40］，其他變異位點也可能是功能位點。特別是華南秈稻中qLTG3-1的等位基因類型并不明確，在華南秈稻中是否存在功能位點，這些問題值得進一步研究。選用遺傳背景一致、供體來源多樣的單片段代換系來進行qLTG3-1的等位基因效應分析將獲得更客觀準確的結果。

4 結論

qLTG3-1是1 個控制水稻低溫發(fā)芽力的重要QTL，其序列變異豐富，存在多種類型的等位基因，+127 位的18 bp 缺失變異在水稻種質中廣泛存在。分子標記Gltg3-1 能特異區(qū)分這18 bp 變異?；贕ltg3-1 的擴增帶型對品種/系分組進行低溫發(fā)芽力差異性檢測，發(fā)現兩組的低溫發(fā)芽力無顯著差異，即qLTG3-1上的18 bp 變異并不能標示水稻低溫發(fā)芽力的強弱。因此，需要對qLTG3-1等位基因的效應進行評價，獲得增強水稻低溫發(fā)芽力的等位基因用于品種改良。來源于南洋占的qLTG3-1能顯著提高低溫發(fā)芽力，該等位基因可用于水稻低溫發(fā)芽力的改良。分子標記Gltg3-1存在于基因內部，可以準確地在雜交后代中選擇到目標基因。