千慧燕，王浩，楊冰祎，閔鵬飛，張爽，賈立軍*

(1. 東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心/延邊大學，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

弓形蟲(Toxoplasmagondii) 屬于真球蟲目弓形蟲科，是一種專性細胞寄生原蟲[1]。在世界范圍內(nèi)流行，具有廣泛的宿主群，哺乳動物、鳥類、人都是它的中間宿主[2-4]。弓形蟲病是人獸共患寄生蟲病，嚴重威脅人類健康，并能引起家畜死亡，造成嚴重經(jīng)濟損失[5-8]。弓形蟲入侵宿主的過程是由多種分泌蛋白介導完成，這些分泌蛋白主要來自弓形蟲頂端復合體微線體蛋白(MICs)、棒狀體蛋白(ROPs)和致密顆粒蛋白(GRAs)等分泌型細胞器[9-11]。

MICs在弓形蟲識別、附著和入侵宿主細胞過程中起重要作用[12]。在蟲體與宿主細胞接觸早期，MICs最先從速殖子頂端分泌，通過識別宿主細胞膜上的受體進行黏附；隨之ROPs分泌到宿主細胞膜的棒狀體頸部蛋白RONs與MICs的頂膜抗原AMA1形成移動連接[13-14]。MIC11位于微線體前端，屬于鈣離子依賴性蛋白，具有在成熟之前移除內(nèi)部前肽的特性[15-16]，其表達具有部分限制性，在速殖子和子孢子期有表達，緩殖子期不表達[17]。MIC11水解部位在其肽鏈中間，而其他微線體蛋白水解部位在其C-末端或N-末端[18]。目前關于弓形蟲MIC11基因的研究報道較少，本試驗利用CRISPR/Cas9技術對MIC11基因進行敲除，并通過乙胺嘧啶、綠色熒光蛋白(GFP)標記及PCR等方法篩選MIC11基因敲除株，以期為弓形蟲MIC11基因的后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體與實驗動物

弓形蟲RH株、Vero細胞均由延邊大學預防獸醫(yī)實驗室保存，清潔級BALB/c小鼠購自延邊大學實驗動物中心，6～8周齡30只。

1.2 主要試劑

DMEM細胞培養(yǎng)液購自Gibico公司，胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技公司，雙抗(青鏈霉素混合液)、胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS和二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶科技有限公司；細胞基因組DNA提取試劑盒、組織基因組DNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；同源重組試劑盒、限制性內(nèi)切酶等購自OMEGA公司；乙胺嘧啶購自上海麥克林生化科技有限公司；SV40-載體由日本帶廣畜產(chǎn)大學原蟲病研究中心惠贈。

1.3 細胞和蟲體培養(yǎng)

用含10%熱滅活胎牛血清、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Vero細胞。2 d更換1次培養(yǎng)液。弓形蟲RH蟲株接種到已長滿的Vero細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件與Vero細胞相同。

1.4 弓形蟲MIC11敲除株的構(gòu)建與篩選

參照謝素珠等[19]方法進行弓形蟲MIC11基因敲除株的構(gòu)建，通過E-CRISP軟件確定弓形蟲RH株MIC11基因(TGGT1_204530)的靶向gRNA序列，設計gRNA引物，采用重疊PCR和同源重組試劑盒將gRNA連接至SV40載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒SV40-MIC11。使用質(zhì)粒電轉(zhuǎn)試劑盒進行轉(zhuǎn)染，將電轉(zhuǎn)后弓形蟲接種于Vero細胞中，培養(yǎng)8 h后加入1 μm乙胺嘧啶繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后在熒光顯微鏡下觀察，當培養(yǎng)瓶中有大量的游離蟲體時，將速殖子重懸于PBS中，純化后計數(shù)板計數(shù)，采用終點稀釋法在96孔板中進行篩選，96孔板細胞長滿后，每孔加入100 μL含1 μm乙胺嘧啶的培養(yǎng)液，第1排每孔接種4個速殖子，混勻后吸取50 μL接種至第2排各對應孔，余下各排依次倍比稀釋至最后一排每孔0.5個速殖子，熒光顯微鏡下觀察最后兩排蟲體熒光情況，標記單個蟲體熒光孔進行擴大培養(yǎng)，即為篩選的單克隆蟲株，暫命名為KO-MIC11株。

1.5 弓形蟲KO-MIC11株的鑒定

根據(jù)弓形蟲B1基因(ToxoDB:AF179871)和MIC11基因(ToxoDB:TGGT1_204530)，以及載體中GFP基因設計引物，提取增殖后的單克隆KO-MIC11敲除株DNA和RH株DNA進行PCR鑒定[20]，引物序列見表1。

表1 KO-MIC11敲除株鑒定引物

1.6 弓形蟲MIC11基因敲除株小鼠體內(nèi)PCR鑒定

將BALB/c小鼠隨機分為3組，每組10只，試驗組小鼠每只腹腔注射KO-MIC11敲除株1 000個，其他兩組對照組小鼠分別注射RH蟲株1 000個及生理鹽水0.1 mL，每天觀察小鼠的臨床癥狀。5 d后處死小鼠，提取其心、肝、脾、肺、腎、腦、生殖器官及血液的DNA。應用B1基因引物和GFP基因引物對提取的DNA進行PCR鑒定。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲MIC11基因敲除株篩選

弓形蟲敲除MIC11基因后，經(jīng)過乙胺嘧啶藥物和終點稀釋法篩選，篩選出的單克隆蟲株在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(見圖1)。

A.單克隆敲除株納蟲空泡；B.單克隆敲除株速殖子

2.2 KO-MIC11株體外不同基因的PCR鑒定

經(jīng)PCR檢測KO-MIC11株和RH株均擴增出B1基因的193 bp條帶；MIC11基因引物在RH株中擴增出274 bp條帶，而在KO-MIC11株中未擴增出該條帶(見圖2)；GFP基因引物在KO-MIC11株中擴增出609 bp條帶，而在RH株未擴增出該條帶(見圖3)。

M. DL2000 Marker；1～2. KO-MIC11株B1基因引物擴增；3～4. RH株B1基因引物擴增；5. 水對照；6. 空泳道；7～8. KO-MIC11株MIC11引物擴增；9～10. RH株MIC11引物擴增；11. 陰性對照

M. DL2000 Marker；1～4. KO-MIC株；5. RH株；6. 陰性對照

2.3 KO-MIC11株小鼠體內(nèi)PCR鑒定

以提取的KO-MIC11株接種小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和血液等基因組DNA為模板，RH株基因組DNA為對照組，分別以B1基因引物和GFP基因引物進行擴增，小鼠體內(nèi)除血液中未擴增出蟲體基因外，其他組織中均擴增出目的基因。KO-MIC11株和RH株均擴增出了B1基因193 bp條帶(圖4)；接種KO-MIC11株小鼠擴增出了GFP基因609 bp條帶，而接種RH株小鼠未擴增出該基因片段帶(圖5)。

M. DL2000 Marker；1～8. 心、肝、脾、肺、腎、腦、生殖器官、血液；9. KO-MIC11株；10. 陰性對照

M. DL2000 Marker；1～8. 心、肝、脾、肺、腎、腦、生殖器官、血液；9. RH株；10. KO-MIC11株；11.陰性對照

3 討論

目前已報道的微線體蛋白MIC有15種以上，它們2種或2種以上相互結(jié)合，以復合體形式存在，在蟲體識別、黏附、入侵宿主細胞過程中起到重要作用[21]。其中MIC2和MIC3為主要研究蛋白[22]。關于MIC11的研究報道較少，Harper等[23]研究表明MIC11蛋白在分泌時，被2個連續(xù)的蛋白酶水解修飾，去除內(nèi)部的前肽，形成成熟蛋白，是MIC家族中唯一的一種特殊結(jié)構(gòu)；Tao等[24]通過MIC11疫苗免疫小鼠后進行攻蟲試驗，表明MIC11疫苗成功提高了小鼠的存活率。本試驗篩選出的單克隆KO-MIC11株接種小鼠后，在小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦及生殖器官中均能擴增出KO-MIC11株B1基因和GFP基因片段，但擴增不出MIC11基因片段，說明本試驗成功構(gòu)建并篩選出MIC11基因敲除的單克隆蟲株。

謝素珠等[19]構(gòu)建了弓形蟲MIC10基因敲除株，通過乙胺嘧啶藥物篩選、GFP綠色熒光觀察進行體外和小鼠體內(nèi)PCR鑒定MIC10基因確定了單克隆敲除蟲株。本試驗在此基礎上進行了改進，對構(gòu)建的弓形蟲KO-MIC11株應用弓形蟲B1基因和MIC11基因，以及載體中GFP基因進行了PCR鑒定，并與弓形蟲RH株進行了比較，結(jié)果表明KO-MIC11株和RH株均擴增出B1基因條帶；RH株擴增出MIC11基因條帶，而KO-MIC11株未擴增出MIC11基因條帶；KO-MIC11株擴增出GFP基因條帶，而RH株未擴增出GFP基因條帶，說明本試驗構(gòu)建的KO-MIC11株能夠在Vero細胞和小鼠體內(nèi)穩(wěn)定增殖，而且GFP基因在KO-MIC11株內(nèi)能夠穩(wěn)定表達。本試驗為弓形蟲MIC11基因敲除株致病性研究奠定了基礎。

相關研究表明，弓形蟲微線體蛋白MIC家族成員與弓形蟲的毒力與致病性密切相關，該家族成員已被用于弓形蟲疫苗的研究[25-26]。目前關于弓形蟲MIC11基因的研究報道較少，本試驗構(gòu)建的弓形蟲KO-MIC11蟲株，為后續(xù)探究MIC11基因?qū)蜗x生長、入侵、增殖、逸出及致病性等功能的影響奠定了基礎；通過接種KO-MIC11株可探究該蟲株對動物抗野生蟲株感染的保護能力，有望用于弓形蟲基因工程疫苗的研發(fā)。