武彩霞 馬曉茜 唐敏芳 于宗琴 李婭寧 霍連廣

匹諾塞林是中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制的一種新型腦保護新藥,屬于黃酮類化合物,蜂膠中含量較高。已有多項研究資料證明,匹諾塞林有抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管舒張等多方面藥理作用［1-6］,能減輕腦缺血再灌注損傷［7］,但其作用靶點仍然不清楚。為進一步探討匹諾塞林腦保護的作用機制,為尋找其作用靶點提供啟示,本文用缺糖缺氧/復糖復氧損傷SHSY5Y 細胞模擬腦缺血再灌注損傷模型,觀察匹諾塞林對細胞內鈣離子［Ca2+］i 變化及Caspase-12 表達的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 匹諾塞林凍干粉,批號 201804；SH-SY5Y 細胞株,中國醫(yī)學科學院基礎研究所提供；DMEM/F12 培養(yǎng)基,標準胎牛血清,Gibco 公司產品；胰蛋白酶、Sigma 公司產品；鈣離子熒光探針Furo 4-AM,Invitrogin 公司產品；Caspase-12(SC-5627)一抗,美國Santa Cruz Biotechnology 公司產品,Dylight651-conjugated 熒光二抗：美國CST 公司產品。

1.2 主要儀器與設備 細胞孵育箱,日本三洋公司；高內涵細胞成像儀,英國Thermo Fisher 公司；超凈純水儀,美國Beckman 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SH-SY5Y 細胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12 基質中培養(yǎng),每2～3 天換液1 次。細胞呈對數(shù)增長時,加0.25%胰蛋白酶消化,200 μl/孔(5000 個/孔)接種在96 孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h 后,更換無糖EBSS 平衡鹽溶液(154 NaCl,5.6 KCl,5.0 HEPES,3.6 NaHCO3,2.3 CaCl2,pH 7.4；單位mmol/L)［8］,隨機分為OGD/R 組及匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組,OGD/R 組不加任何藥物；匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組調整終濃度分別為0.01、0.10、1.00 μM。三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2,1%O2,94%N2；培養(yǎng)2 h 后,移除培養(yǎng)液,更換完全培養(yǎng)基,復糖復氧培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃,5%CO2,飽和濕度下培養(yǎng)12 h。對照組更換完全培養(yǎng)基,正常條件下培養(yǎng)。

1.3.2 匹諾塞林對細胞Caspase-12 表達的影響 根據(jù)細胞凋亡的研究結果(另文發(fā)表),高內涵成像分析內質網應激損傷的SH-SY5Y 細胞內Caspase-12 表達的變化。

上述細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后,用預溫的PBS 洗滌細胞3 次,37℃條件下,4%多聚甲醛100 μl 固定20 min。吸除固定液,PBS 再洗滌3 次,用0.5% Triton X-100/PBS 100 μl 室溫條件下孵育10 min 后,PBS 再洗滌3 次；用含2%胎牛血清的PBS 37℃孵育60 min,吸除,加入一抗50 μl(1∶200 稀釋)4 ℃孵育過夜；吸除一抗,PBS洗滌3 次后,加入Dylight651-conjugated 熒光二抗50 μl(1∶200 稀釋)避光孵育2 h(37℃)；吸除二抗,PBS 洗滌2 次,棄去上清,最后加入PBS 200 μl 于高內涵成像儀拍照分析。

1.3.3 匹諾塞林對細胞內鈣離子的影響 預先用0.01%多聚賴氨酸包被96 孔板,按前述方法接種細胞。除去培養(yǎng)基,使用HBSS 溶液洗滌細胞3 次。每孔加入Fluo 4-AM 工作液(用HBSS 溶液稀釋配制,濃度5 μM)50 μl,37℃孵育30min。用HBSS 溶液洗滌細胞3 次,每孔加入100 μl HBSS 溶液,高內涵成像儀拍照分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0 進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用單因素方差分析(one-wayanalysis of variance,ANOVA)進行多組間數(shù)據(jù)比較。結合Student-Newman-Keuls 檢驗,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 匹諾塞林對細胞內Caspase-12 表達的影響 與對照組比較,OGD/R 組細胞內Caspase-12 表達顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與OGD/R 組比較,匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞內Caspase-12 表達均降低,其中匹諾塞林中劑量組、高劑量組細胞內Caspase-12 表達均低于OGD/R 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 匹諾塞林對OGD/R 損傷SH-SY5Y 細胞內Caspase-12 表達的影響

2.2 匹諾塞林對OGD/R 損傷SH-SY5Y 細胞內鈣離子的影響與對照組比較,OGD/R 組細胞內［Ca2+］i 顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與OGD/R 組比較,匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞內［Ca2+］i均下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或0.01)。見圖2。

圖2 匹諾塞林對OGD/R 損傷SH-SY5Y 細胞內［Ca2+］i 的影響

3 討論

SH-SY5Y 細胞株來源于人類胚胎中腦,其細胞形態(tài)、生理生化功能與正常神經元相似［9］。通過缺糖缺氧后快速恢復氧糖供應損傷SH-SY5Y 神經細胞,可在細胞水平模擬臨床腦缺血再灌注損傷,進行細胞機制和藥物研究［10-12］。在本實驗中,采用OGD/R 損傷的SH-SY5Y 神經細胞模型,證實匹諾塞林可以減輕OGD/R 造成的［Ca2+］i 升高及Caspase-12 表達增加。

關于匹諾塞林,已有大量資料證實其可以減輕腦缺血再灌注損傷［7］。關于腦缺血再灌注損傷的病理機制非常復雜,近些年來,腦缺血再灌注時內質網應激發(fā)生啟動的細胞凋亡通路引起廣泛關注［13,14］。內質網應激引起的細胞凋亡主要有三條途徑：Caspase-12 的激活、CHOP/GADD153 轉錄激活及c-jun 氨基末端激酶(JNK)誘導凋亡［15］。本實驗室已經證實,OGD/R 損傷SH-SY5Y 神經細胞,可引起內質網應激發(fā)生,細胞凋亡增加,匹諾塞林可以減少CHOP/GADD153 表達,減少細胞凋亡(該研究結果另文發(fā)表),本研究繼續(xù)探討對Caspase-12 的影響。

Caspase-12 是內質網外膜上介導細胞凋亡的一種特異性蛋白酶,其表達水平的高低直接反映內質網應激水平。通常Caspase-12 主要以無活性的前體形式存在,在內質網應激發(fā)生時活化［16］,活化的Caspase-12從內質網進入到細胞漿中作用于Caspase-9,激活Caspase-3 引起細胞凋亡［17,18］。匹諾塞林能下調OGD/R損傷的SH-SY5Y 細胞Caspase-12 的表達,這可能是也是其抗凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷的機制之一。

研究表明,細胞內Ca2+可能是主動調控細胞凋亡的重要因素,細胞內Ca2+濃度升高參與了細胞凋亡早期的信號轉導和細胞凋亡的執(zhí)行階段。內質網儲存細胞內80%～90%Ca2+,腦缺血再灌注時,引發(fā)細胞凋亡的多種刺激因素均可使Ca2+從內質網中釋放,造成細胞內Ca2+顯著增加［19］,繼而引起線粒體通透孔的開放,導致線粒體腫脹、線粒體內Ca2+超載,最終導致線粒體外膜破裂；同時釋放的Ca2+還可以激活鈣調神經磷酸酶、鈣蛋白酶、死亡相關蛋白酶和其相關的線粒體分裂融合蛋白,促使細胞色素C 釋放,最終導致細胞凋亡。因此細胞凋亡的線粒體相關信號途徑與內質網結構功能及［Ca2+］i 密切相關［20,21］。

由上可知,內質網內Ca2+的耗竭是內質網應激誘導細胞凋亡發(fā)生的主要原因,相反,阻止內質網的Ca2+外流可以促進細胞生存［22］。還有學者認為,Caspase-12的活化也與細胞Ca2+平衡失調有關［17］。在本實驗中,匹諾塞林降低細胞內［Ca2+］i,聯(lián)系本實驗室前期的研究結果——匹諾塞林能保護線粒體的結構和功能［23-25］,推測匹諾賽林可能在腦缺血再灌注的內質網應激發(fā)生時,對維持內質網正常結構和功能有幫助,而這可能是其線粒體保護作用的上游事件。此外,匹諾塞林下調Caspase-12 表達,也可能與其降低細胞內［Ca2+］i 有關。但是,對于OGD/R 損傷SH-SY5Y 細胞后,匹諾塞林降低細胞內鈣的具體機制是什么,還需要更加深入的探討。