王若男 曹錕

摘要：亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T的基因多態(tài)性會影響葉酸代謝。為了研究C677T（A177V）對于該酶構象的影響，我們采用分子動力學模擬的方法，針對MTHFR-野生型（MTHFR-WT）和A177V突變體分別進行了100?ns的模擬計算，分析了該酶整體構象差異及其FAD活性中心的變化。研究發(fā)現，與MTHFR-WT相比，A177V模擬體系無法趨于穩(wěn)定，突變體a-C的均方根漲落值升高，回旋半徑值增大，溶劑可及表面積增大，這些結果都表明，A177V突變會導致該酶的整體結構松散且不穩(wěn)定升高;進一步的二級結構含量及FAD活性中心的分析表明，A177V突變會引起部分a螺旋含量降低、b折疊含量升高，且造成FAD結合位點殘基的空間距離增大，這些結果表明A177V突變會破壞FAD結合位點微環(huán)境。本研究在原子水平揭示了A177V突變會誘導MTHFR激活劑FAD解離的關鍵信息。

關鍵詞：分子動力學模擬;亞甲基四氫葉酸還原酶;黃素腺嘌呤二核苷酸;突變體;穩(wěn)定性

亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是機體葉酸代謝過程中的關鍵限速酶，它能催化5，10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸轉換，隨后會進入甲基傳遞通路，為DNA、蛋白質甲基化提供甲基，為同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸。葉酸是人體體內重要的水溶性維生素B族營養(yǎng)素，是對具有蝶酰谷氨酸分子結構化合物的總稱[1-2]。葉酸在細胞分裂、蛋白質合成等途徑中具有重要作用，葉酸攝入不足或者代謝障礙，可能造成人體同型半胱氨酸積累、血紅蛋白生成減少進而導致貧血，甚至可能導致神經管畸形、智力低下、心腦血管等疾病[3]。

MTHFR?C677T具有基因多態(tài)性，這直接決定了酶活性以及葉酸利用率。根據文獻報道，與MTHFR-WT相比，C677T基因突變會造成該酶的熔解溫度下降6℃且酶活性僅有26%，從而引起葉酸、甲基代謝紊亂，所以該酶參與了人類重要疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究項目將通過分子動力學模擬的手段揭示C677T對于該酶構象的影響，并闡明其誘導FAD配體解離的分子機制。

1材料與方法

1.1分子模擬的條件

本研究中大腸桿菌MTHFR的結構（PDB：1b5t）來自于RCSB蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）。在使用Gromacs2020.4軟件進行分子模擬計算之前，需要先除去MTHFR結構中的結晶水和雜質離子，此后需要通過PymoL軟件將Ala-177突變成Val-177，即A177V。針對MTHFR和A177V設置兩個獨立的體系，采用SPC水模型、Gromos43a1力場進行總時長為100?ns模擬[5-6]。將MTHFR和A177V的晶體構象放置在立方周期盒中并作為起始構象，將蛋白與盒子邊界的最小距離設定為1.0?nm，模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X/Y/Z三個方向。在溶膠中加入0.15?mol/L?NaCl鹽溶質以便于中和蛋白體系的電荷。接下來，采用蛙跳算法計算每個原子的運動，用粒子網格法計算PME靜電相互作用。我們利用最速下降能量法進行400步能量最小化，并對MTHFR和A177V的模擬體系進行了50?ps的位置約束仿真。采用隨機初始速度作為正式動力學模擬的初速度。利用PyMOL、VMD以及Origin8.5軟件生成數據結果。

1.2模擬結果的分析

我們利用VMD-1.9.1軟件觀察兩個不同模擬體系的軌跡中蛋白構象變化[7]，采用gmx?rms、gmx?rmsf和gmx?gyrate工具分別計算了蛋白的RMSD變化、每個氨基酸殘基的a-C的均方根漲落RMSF以及回旋半徑[8]。并采用gmx?distance分別測量了MTHFR和A177V中的典型FAD結合位點殘基的平均距離。并用PyMOL繪制結構圖，用Origin8.5軟件繪制曲線圖。

2?結果與分析

2.1?MTHFR-WT與A177V的整體構象變化

大腸桿菌MTHFR酶的三維構象主要呈現桶狀結構，由296個氨基酸殘基組成，其分子量約為33.1?kDa。其中，Ala-177與人類MTHFR中的Ala222相對應，位于桶底附近，遠離FAD。大多數a-螺旋位于桶的外側周圍，主要作用是向內形成一個疏水囊;而桶的內部是輔酶因子FAD的主要活性區(qū)域，由7個b-折疊形成疏水區(qū)域，這對于穩(wěn)定蛋白的整體構象至關重要。

均方根誤差（root?mean?square?deviation，RMSD）是衡量體系是否達到平衡狀態(tài)的重要依據。MTHFR-WT在70?ns即達到平衡狀態(tài)，對應的平均RMSD值最低約為3.6??（圖1A）;而A177V突變體蛋白的RMSD值在100?ns的總模擬時間內無法達到平衡狀態(tài)，其RMSD最大值高達4.3??以上，說明Ala-177殘基被突變成Val-177會導致蛋白結構不穩(wěn)定。

通過對比MTHFR-WT與A177V中每個a-C原子相對于其平均位置的漲落（RMSF）值的變化，能夠直觀反應出Ala-177突變引起的殘基柔性差異。通常情況下，RMSF值越低則該殘基的靈活性越小，我們將MTHFR-WT的RMSF值定義為正常值;與正常值相比，A177V突變體的多數殘基的RMSF值增大，這表明Ala-177的突變已經對蛋白的碳骨架的波動性造成較大影響（圖1B）。因此，這些結果都表明A177V的突變會導致多數殘基的波動性增大，甚至造成蛋白構象不穩(wěn)定性，這不利于蛋白發(fā)揮酶活性。

2.2?蛋白的回旋半徑及其構象的溶劑可及表面積分析

接下來，我們統(tǒng)計了MTHFR-WT及其突變體的回旋半徑（Rg）隨模擬時長的變化情況，蛋白的Rg值越大表示蛋白構象越靈活，該值越小說明構象越趨近于剛性。在MTHFR-WT和A177V的體系中，蛋白樣品a-C的Rg值分別為1.77?nm和1.81?nm（圖2A）。接下來，我們采用gmx?sasa分別計算了蛋白整體的溶劑可及表面積SASA隨著時間變化情況，平衡狀態(tài)下的MTHFR-WT所對應的SASA值降低至117.5?nm2，與之相比A177V的SASA值則升高至125.1?nm2（圖2B）。這些結果說明，回旋半徑與溶劑可及表面積的數據趨勢與RMSD及RMSF結果保持一致，即Val-177突變將導致該酶的空間構象由致密變得更加松散，這不利于蛋白構象保持穩(wěn)定。該結論從原子水平解釋了A177V突變體的熔解溫度比野生型下降了6℃這一科學問題。

2.3對比MTHFR-WT與A177V的二級結構變化以及FAD的結合能力

為了探究Ala-177被突變成Val-177所引起的二級結構變化差異，我們采用do_dssp插件解析了蛋白的二級結構含量。A177V模擬體系的二級結構改變情況與MTHFR-WT正常體系形成鮮明對比，MTHFR-WT平均有122個殘基參與a螺旋的形成，19個形成b-轉角（圖3A）;然而，在A177V突變體中有125個殘基形成a螺旋，17個形成b-轉角（圖3B）。這些數據表明Ala-177被突變成Val-177可能會導致一部分氨基酸殘基由b-轉角轉化為a螺旋，從而改變了二級結構含量占比。由于MTHFR酶的b-轉角具有穩(wěn)定蛋白骨架的作用，因此b-轉角含量的降低可能會破壞其結構穩(wěn)定性，甚至降低該酶的催化活性，這個結果與文獻報道的A177V酶活性僅有26%相一致。

由于FAD是MTHFR酶的底物輔酶因子，接下來我們分析了MTHFR-WT和A177V分別與底物FAD分子的結合位點，經過分析，我們確定了大腸桿菌MTHFR-WT的FAD結合位點殘基為Trp-60、His-88、Arg-118、Gly-119、Asp-120、Ala-132、Trp-152、His-156、Asp-165、Asn-168、Arg-171和Lys-172（圖3C），由此可見FAD的結合方式極為嚴苛。然而，上述諸多證據已經揭示A177V突變體的氨基酸殘基波動性較大、整體構象趨于松散狀態(tài)，因此這些結合位點殘基之間的空間距離也隨之增大（圖3D），具體表現在Trp-60和His-88與其他殘基之間的距離增大為12.2??和15.9??，而其余結合位點的空間位置則被壓縮，不利于FAD底物分子的結合，這可能是由于氨基酸殘基的靈活性較大、局部二級結構被轉換導致的結果。總之，這些數據從原子水平證實A177V突變體不利于結合輔酶因子FAD，故無法充分發(fā)揮其催化活性。

3?討論

據文獻報道，Brian?D.Guenther等人已證實MTHFR-WT的熔解溫度大約為53.1?°C，而A177V的熔解溫度僅有46.0?°C，并且A177V的酶活性僅為野生型的26%[9-10]，然而這一科學問題并未從原子水平角度被更好的解釋。因此，本研究通過分子動力學模擬的手段，探究A177V突變體所造成的蛋白構象變化，具有一定的生物學意義。在這項研究中，我們采用分子動力學模擬的手段分析了MTHFR-WT和A177V突變體蛋白的原子空間構象差異，從RMSD、RMSF、Rg、SASA、二級結構改變及FAD結合能力等方面證實，A177V突變體會引起氨基酸殘基的波動性增大、碳骨架的不穩(wěn)定性升高、蛋白空間構象由致密變得松散等結論，并導致底物分子FAD的活性區(qū)域被破壞，最終造成該酶的熔解溫度降低以及酶活性降低。在臨床病例中，MTHFR的大多數突變屬于C677T突變，即形成A177V突變體，這將誘導MTHFR酶無法正常結合FAD配體分子?？傊?，本研究在原子水平揭示了C677T對于該酶構象的影響，并闡明其誘導FAD配體解離的分子機制。

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基金項目：國家自然科學基金青年項目（82002104）;廣東省基礎與應用基礎研究基金項目區(qū)域聯(lián)合基金-青年基金項目（2019A1515?110659）;廣東省醫(yī)學科學技術研究基金項目（A2020381）;2019年度廣東醫(yī)科大學博士學位人員科研啟動基金（B2019018）;2020年度廣東醫(yī)科大學科研基金自然科學類面上培育項目（GDMUM2020016）。

*通訊作者：曹錕（1989-），男，助理研究員，博士研究生，研究方向：醫(yī)學生物化學。

作者簡介：王若男（1991-），女，助理實驗師，碩士研究生，研究方向：食品科學和生物化學。