吳 亮，陳文穎，閆統(tǒng)帥，周世水

（華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

糯米酒是中國歷史悠久的特色飲料酒[1]，糯米作為主要發(fā)酵原料，經(jīng)過浸米、蒸飯、酒曲糖化和發(fā)酵等步驟釀制而成[2]，因其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和多糖多肽等營養(yǎng)物質(zhì)，深受人們的喜愛[3-4]。高級醇是糯米酒中重要的呈香呈味物質(zhì)[5]，合適的高級醇濃度可以顯著改善糯米酒的品質(zhì)和風味[6-7]，然而高級醇濃度過高時，會給酒體帶來苦味和異雜味，也是糯米酒容易使人上頭的原因之一[8]。

高級醇俗稱雜醇油，是三個及以上碳原子一價醇類的總稱[9]。糯米酒中的高級醇主要包括異戊醇、異丁醇、正丙醇和β-苯乙醇，它們都是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）次級代謝副產(chǎn)物[10]。釀酒酵母中高級醇的合成主要包括兩條代謝途徑[11]：氨基酸分解途徑（Ehrlich途徑）和生物合成途徑。Ehrlich途徑中，支鏈氨基酸經(jīng)過轉(zhuǎn)氨反應形成α-酮酸，然后α-酮酸經(jīng)脫羧和脫氫反應形成高級醇[12]。生物合成途徑中，糖代謝形成的丙酮酸經(jīng)三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）形成α-酮酸，再經(jīng)過脫羧和脫氫形成相應的高級醇[13]。

釀酒酵母ADH2基因編碼的乙醇脫氫酶參與了高級醇合成過程的脫氫步驟，它與其他高級醇合成相關基因協(xié)同提高異丁醇、異戊醇[14]和β-苯乙醇的生成量[15-16]，而敲除ADH2基因?qū)ε疵拙聘呒壌忌闪康挠绊懷芯可跎?。THI3基因編碼的類丙酮酸脫羧酶被鑒定為亮氨酸代謝的主要脫羧酶，它催化2-酮異己酸形成異戊醇[17]。STYGER G等[18]通過敲除釀酒酵母THI3基因，導致主要高級醇的生成量都下降。

本研究構建了ADH2和THI3基因敲除的單倍體重組酵母，再雜交成重組雙倍體酵母，應用于糯米酒發(fā)酵來研究ADH2和THI3基因敲除對高級醇生成的影響，為降低糯米酒中高級醇的含量提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本實驗所用菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 本實驗所有菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

1.1.2 主要試劑

安琪白酒曲：安琪酵母股份有限公司；ApexHF HS脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒：湖南艾科瑞生物科技有限公司；遺傳霉素（G418）、博來霉素（Zeocin）：北京普博欣生物科技有限責任公司；引物：上海生工生物工程有限公司合成；酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙酸丁酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；半乳糖、無水乙酸鈉、氯化鉀、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基[19]

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L。

浸酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

半乳糖誘導培養(yǎng)基（yeast extract peptone galactose，YEPG）：半乳糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L。

麥氏（McClary）產(chǎn)孢培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，氯化鉀0.18%，無水乙酸鈉0.82%，酵母提取粉0.25%，瓊脂2%。

所有固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎上添加2%瓊脂，并都需115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、PowerPac 3000電泳儀、Gel Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；5804R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；GC8100氣相色譜儀（gaschromatography，GC）：滕州中科普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據(jù)美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫中釀酒酵母（S.cerevisiae）S288c基因組序列，采用Primer 5.0軟件設計聚合酶鏈式反應（PCR）引物見表2。

表2 本實驗使用的引物Table 2 Primers used in the study

1.3.2 基因敲除組件的構建

ADH2基因敲除組件構建：以DC-S和DC-A為引物，質(zhì)粒PUG6為模板，擴增得到KanMX抗性基因片段（1 703 bp，loxp-KanMX-loxp片段）。以酵母基因組作為模板，分別用引物對ADH2-E/ADH2-F和ADH2-G/ADH2-H合成ADH2基因上游同源臂AU（165 bp）和下游同源臂AD（185 bp）。再用融合PCR方法將三個片段連接成ADH2基因敲除組件AUloxp-KanMX-loxp-AD（1 957 bp）。

THI3基因敲除組件構建：以THI3-R和THI3-T為引物，質(zhì)粒PUG6為模板，擴增得到KanMX抗性基因片段（1 767bp，loxp-KanMX-loxp片段）。以酵母基因組作為模板，分別用引物對THI3-E/THI3-F和THI3-G/THI3-H合成THI3基因上游同源臂TU（299 bp）和下游同源臂TD（256 bp）。利用融合PCR將三個片段連接成THI3基因敲除組件TU-loxp-KanMXloxp-TD（2 244 bp）。

1.3.3 重組酵母菌株的構建

（1）重組單倍體酵母菌株的獲得

本研究采用電轉(zhuǎn)化法[20]，將ADH2基因敲除組件轉(zhuǎn)化到酵母菌XF1a7和XF1α6，通過同源重組獲得重組菌XF1a7-AK和XF1α6-AK。通過含200 μg/mL G418抗生素的YEPD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并進行PCR驗證。然后利用Cre/loxP重組系統(tǒng)去除KanMX抗性標記，將Cre重組酶表達載體PSH65質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XF1a7-AK和XF1α6-AK中，YEPG培養(yǎng)誘導Cre表達并切除KanMX抗性標記。再通過傳代的方式使PSH65質(zhì)粒丟失，最終獲得ADH2基因缺失的重組菌XF1a7-A和XF1α6-A?；蚯贸^程如圖1所示。

圖1 ADH2和THI3基因敲除過程Fig.1 Knockout process of gene ADH2 and THI3

類似地，將THI3基因敲除組件轉(zhuǎn)化到XF1a7-A和XF1α6-A中，篩選獲得XF1a7-ATK和XF1α6-ATK，最終得到ADH2和THI3雙基因缺失的酵母菌XF1a7-AT和XF1α6-AT。

（2）重組雙倍體酵母菌株的構建

通過不同配型重組單倍體酵母的雜交得到重組雙倍體酵母菌[21]。首先，將菌株接種到10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中30 ℃活化培養(yǎng)12～16 h，然后各取1 mL a型和α型單倍體酵母菌液接種到3 mL YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交24 h，用顯微鏡觀察雜交情況，并將雜交菌液涂布到YEPD平板中培養(yǎng)2 d，挑取較大的菌落劃線到產(chǎn)孢培養(yǎng)基中26 ℃培養(yǎng)5～7 d，若能產(chǎn)生孢子則為雜交成功的重組雙倍體酵母菌株。

1.3.4 生長曲線的繪制

挑取一環(huán)酵母菌接種到10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。再將菌液按2%的比例接種到100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)，每2h取樣測波長600nm的吸光度值（OD600nm值）。以OD600nm值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.3.5 發(fā)酵試驗

從試管斜面取一環(huán)酵母菌接種到10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，取2 mL菌液接種到含18 mL YEPD液體培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，30 ℃搖床培養(yǎng)16 h，得到種子液。

取40 g糯米、100 mL水加入250 mL燒杯中，浸泡2 h，蒸飯后冷卻，加入10 mL種子液、0.8 g酒曲，攪拌均勻，30 ℃發(fā)酵4 d。

1.3.6 樣品處理

發(fā)酵糯米酒過濾酒液，測定其還原糖，另取100 mL濾液和100 mL水到1 000 mL蒸餾燒瓶中蒸餾出100 mL酒液，測定酒精度和高級醇含量。

1.3.7 分析方法

CO2釋放量采用稱質(zhì)量法測量[22]、殘留還原糖用3,5-二硝基水楊酸法測定[23]、酒精度用酒精計法測定[24]，高級醇等揮發(fā)性物質(zhì)通過氣相色譜內(nèi)標法測定[25]，內(nèi)標為乙酸丁酯，氣相色譜相關參數(shù)如下：

色譜柱為LZP-930白酒分析毛細管柱（25 m×0.53mm×1.0 μm）；高純氮氣（N2）為載氣，載氣流速30 mL/min；柱箱的升溫程序為50 ℃保持5 min，以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持5 min。檢測器溫度230 ℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣速度30 mL/min；進樣口溫度220 ℃，進樣體積0.4 μL。

2 結果與分析

2.1 重組酵母菌株的構建和驗證

按照1.3.3的方法構建重組菌株，陽性轉(zhuǎn)化子菌株通過PCR驗證，分別用引物ADH2-A/ADH2-D（基因兩端驗證引物）、ADH2-A/B-M（上游驗證）和C-M/ADH2-D（下游驗證）對重組單倍體酵母菌株進行PCR驗證，結果見圖2。由圖2可知，XF1a7的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為1 557 bp、無條帶、無條帶，XF1a7-AK的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為2 057 bp、882 bp、1 020 bp，XF1a7-A的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為550 bp、無條帶、無條帶，PCR驗證條帶和預期一致，因此成功獲得ADH2基因敲除的單倍體酵母菌。

圖2 重組單倍體酵母菌株XF1a7-AK、XF1a7-A的PCR驗證Fig.2 PCR verification of recombinant haploid yeast strains XF1a7-AK and XF1a7-A

對ADH2敲除菌進行THI3基因的敲除，陽性轉(zhuǎn)化子分別用PCR引物對THI3-A/THI3-D（基因兩端驗證引物）、THI3-A/B-M（上游驗證）和C-M/THI3-D（下游驗證）進行PCR驗證，結果見圖3。由圖3可知，XF1a7-A的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為1 897 bp、無條帶、無條帶，XF1a7-ATK的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為2 355 bp、1 067 bp、1 133 bp，XF1a7-AT的基因兩端驗證、上游驗證、下游驗證的結果分別為848 bp、無條帶、無條帶，PCR驗證條帶和理論一致，因此成功獲得ADH2和THI3雙基因敲除的單倍體酵母菌株。

圖3 重組單倍體酵母菌株XF1a7-ATK、XF1a7-AT的PCR驗證Fig.3 PCR verification of recombinant haploid yeast strains XF1a7-ATK and XF1a7-AT

根據(jù)1.3.3的方法，通過XF1a7-A和XF1α6-A雜交得到重組雙倍體XF1-A，XF1a7-AT和XF1α6-AT雜交得到重組雙倍體XF1-AT，結果見圖4。由圖4可知，許多啞鈴型細胞，即為單倍體雜交過程形態(tài)。菌株XF1-A和XF1-AT的產(chǎn)孢驗證見圖5。由圖5可知，XF1-A和XF1-AT都能產(chǎn)生孢子，說明XF1-A和XF1-AT都是成功雜交的雙倍體酵母菌。

圖4 重組單倍體的雜交過程形態(tài)Fig.4 Morphology of hybridization of recombinant haploid

圖5 重組雙倍體酵母的產(chǎn)孢驗證Fig.5 Verification of sporulation of recombinant diploid yeast

2.2 雙倍體重組菌的生長性能

根據(jù)1.3.4的方法，繪制原始酵母XF1、重組雙倍體酵母XF1-A和XF1-AT的生長曲線，結果見圖6。由圖6可知，重組菌XF1-A的生長曲線和原始菌XF1幾乎相同，雙基因缺失酵母XF1-AT的前期的生長速率略微低于菌株XF1，但是最終生物量都沒有顯著差異。這表明ADH2和THI3雙基因缺失對酵母菌體生長性能影響不大。

圖6 重組菌和原始菌XF1的生長曲線Fig.6 Growth curves of recombinant strains and original strain XF1

2.3 ADH2和THI3基因敲除對糯米酒高級醇生成的影響

重組雙倍體酵母菌株和原始菌發(fā)酵糯米酒高級醇生成量見圖7。

圖7 重組菌和原始菌XF1高級醇生成量Fig.7 Higher alcohols production of recombinant strains and original strain XF1

由圖7可知，菌株XF1-A的總高級醇生成量為522.16 mg/L，比菌株XF1降低11.16%（P＜0.05），其中異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇分別降低12.08%、11.32%和16.31%。菌株XF1-AT的高級醇生成量最低，為462.03 mg/L，比菌株XF1降低21.39%，其中正丙醇、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇分別降低15.10%、25.70%、19.63%和28.17%。

實驗結果表明ADH2基因缺失的酵母能降低高級醇的生成量，但是降低幅度只有11%左右，原因可能是酵母中存在多種脫氫酶都能催化該脫氫反應[12]，而ADH2基因編碼的脫氫酶不是主要脫氫酶的緣故。ADH2和THI3基因缺失的酵母能顯著降低高級醇的生成量（P＜0.05），原因是THI3基因編碼的脫羧酶參與高級醇合成中α-酮酸的脫羧，THI3的缺失減少了相應醛的生成，而ADH2基因缺失又減少這些醛脫氫形成的高級醇，因而協(xié)同降低了高級醇的生成量。

2.4 ADH2和THI3基因敲除對發(fā)酵性能的影響

重組雙倍體酵母菌株和原始菌糯米酒發(fā)酵后的基本發(fā)酵性能測定結果見表3。由表3可知，重組菌XF1-A和XF1-AT的CO2產(chǎn)生量、殘留還原糖、酒精度與原始菌XF1相比都無顯著差異（P＞0.05），說明ADH2和THI3基因缺失不影響酵母的基本發(fā)酵性能。

表3 重組菌和原始菌XF1的基本發(fā)酵性能的比較Table 3 Comparison of basic fermentation performance of recombinant strains and original strain XF1

3 結論

本實驗成功構建了ADH2單基因缺失、ADH2與THI3雙基因缺失的單倍體酵母菌和雙倍體酵母菌。雙倍體重組菌株XF1-A、XF1-AT與原始菌XF1的生長性能、發(fā)酵性能都相似，但是釀造糯米酒中的高級醇生成量分別降低11.16%、21.39%。因此，本實驗構建的重組雙倍體酵母菌XF1-AT可顯著降低糯米酒中高級醇生成量，具有潛在的工業(yè)應用價值。