黃秋萍，黃秋嬋，鄭燕菲，韋友歡，翁艷英，黃曉敏，曾振芳

（廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西 崇左 532200）

余甘子（Phyllanthus emblicaL.）別名喉甘子、庵羅果、牛甘果等，屬大戟科葉下珠屬植物，廣泛分布于我國(guó)西南等地區(qū)，其果實(shí)入口微澀，回味甘甜，故名余甘[1-3]。余甘子果實(shí)具有清熱利咽，生津止渴，潤(rùn)肺化痰等功能，主要用于治療感冒發(fā)熱、咳嗽、咽痛、白喉、煩熱口干[4-6]，降糖、調(diào)節(jié)血脂代謝等作用顯著[7]。余甘子是聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織指定為全世界推廣種植的3種保健植物之一，且在17個(gè)國(guó)家的傳統(tǒng)藥物體系中使用[8]，為藥食兩用植物。

目前，余甘子植物的研究主要集中在余甘子果實(shí)、葉中總黃酮、多酚物質(zhì)的提取[9-10]；余甘子抗氧化、護(hù)肝、調(diào)節(jié)血脂及抗癌等藥理作用的研究[11-13]。研究表明，余甘子中主要的生物活性成分之一是水解單寧[14]，余甘子多酚具有抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗病毒和腫瘤等作用[15-18]。但關(guān)于余甘子果核有效成分的提取工藝及抗氧化活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

余甘子果核占干果質(zhì)量的40%左右，在臨床應(yīng)用中并未嚴(yán)格區(qū)分余甘子果肉和余甘子，2020年版《中國(guó)藥典》也僅收載了余甘子，并未對(duì)其果肉有所規(guī)定[15]。但是在產(chǎn)地加工時(shí)，部分余甘子會(huì)經(jīng)過(guò)去核的方法凈制后再流通進(jìn)入市場(chǎng)或應(yīng)用于臨床。為了更好地開(kāi)發(fā)和完善余甘子植物的綜合利用，使廢棄的余甘子果核得到充分利用，減少資源浪費(fèi)，試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取余甘子果核多酚，并通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化余甘子果核多酚的提取工藝條件，并研究余甘子果核多酚對(duì)羥基自由基（·OH）及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（DPPH·）的清除作用考察其抗氧化活性，以期為余甘子果核在食品保健和藥用開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘果：2020年7月采摘于廣西崇左市江州區(qū)；

單寧酸（純度≥99%）、維生素C（vitamin C，VC）、福林酚、丙酮、DPPH等實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SG2200HPT型超聲波清洗儀：上海冠特超聲儀器有限公司；SHZ-D型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 余甘子果核多酚的提取

參考文獻(xiàn)[19]的方法，對(duì)余甘子果核進(jìn)行預(yù)處理：將采摘的余甘果洗凈自然晾干，人工對(duì)果實(shí)、果核進(jìn)行分離，果核洗凈后放置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩即得余甘子果核粉末。用石油醚以1∶4料液比（g∶mL）在70 ℃油浴條件下對(duì)余甘子果核粉末進(jìn)行脫脂、除色處理，回流4 h，抽濾，再放置60 ℃干燥箱中干燥，即得脫脂脫色的余甘子果核粉末原料，于常溫條件下密封避光保存以備用。

稱取已脫脂脫色的1.000 0 g余甘子果核粉末加入一定量丙酮溶液，于一定條件下超聲輔助提取，抽濾，所得濾液用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，即得余甘子果核多酚提取液，待用。

1.3.2 余甘子果核多酚提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以余甘子果核多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察提取劑（體積分?jǐn)?shù)70%丙酮、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇（1%鹽酸）酸性溶液、蒸餾水）、丙酮體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL））、提取時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）、提取溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）對(duì)余甘子果核多酚得率的影響。

1.3.3 余甘子果核多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）及提取溫度（D）為4個(gè)考察因素，以余甘子果核多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化余甘子果核多酚提取工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 余甘子果核多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel extraction technology optimization

1.3.4 測(cè)定方法

余甘子果核多酚得率的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[20]的方法，配制不同濃度梯度的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用福林酚顯色法，顯色后分別測(cè)定它們?cè)诓ㄩL(zhǎng)760 nm處的吸光度值，以單寧酸溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程：y=93.780 4x+0.079 6，R2=0.999 0。

根據(jù)單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法顯色后測(cè)定余甘子果核多酚提取液在波長(zhǎng)760 nm處的吸光度值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相關(guān)濃度，根據(jù)下式計(jì)算余甘子果核多酚的得率：

式中：Y為余甘子果核多酚的得率，%；WR為脫脂原料的質(zhì)量，g；C為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為提取液的總體積，mL；V2為測(cè)定時(shí)量取的提取液體積，mL。

余甘子果核多酚抗氧化性的測(cè)定：在正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳工藝條件下提取余甘子果核多酚，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，參照文獻(xiàn)[21-22]的方法，分別測(cè)定余甘子果核多酚對(duì)·OH及DPPH·的清除能力，以對(duì)應(yīng)清除率為參考指標(biāo)評(píng)價(jià)余甘子果核中多酚的抗氧化活性。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值，采用Origin8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對(duì)余甘子果核多酚得率的影響

如圖1所示，不同提取劑提取余甘子果核多酚對(duì)應(yīng)得率由大到小順序?yàn)椋?0%丙酮＞70%乙醇（1%鹽酸）＞70%乙醇＞蒸餾水，以體積分?jǐn)?shù)70%的丙酮作為提取劑時(shí)提取得到的余甘子果核多酚得率最大，為4.58%。原因是丙酮極性與多酚物質(zhì)相近，相似相溶原理使得其提取率相對(duì)較高，因此，確定丙酮溶液為余甘子果核多酚的最佳提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)余甘子果核多酚得率的影響Fig.1 Effect of extracting agent on extraction rate of polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel

2.1.2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)余甘子果核多酚得率的影響

如圖2所示，余甘子果核多酚的提取率隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大先緩慢升高后顯著降低。當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)對(duì)應(yīng)得率最大為5.60%，繼續(xù)增大丙酮體積分?jǐn)?shù)，則脂溶性物質(zhì)溶出增多，使得多酚的得率下降[20]。因此，選取的最佳丙酮體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)余甘子果核多酚得率的影響Fig.2 Effect of acetone volume fraction on extraction rate of polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel

2.1.3 料液比對(duì)余甘子果核多酚得率的影響

如圖3所示，隨著料液比的變化余甘子果核多酚得率先升高后緩慢降低，當(dāng)料液比為1∶30 g/mL對(duì)應(yīng)的多酚得率最大為5.90%，原因可能是適當(dāng)增大提取劑用量可利于余甘子果核多酚的溶出，但提取劑用量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出也增多，從而導(dǎo)致多酚得率下降[23]，且不利于后續(xù)濃縮處理。因此，選取的最佳料液比為1∶30（g∶mL）。

圖3 料液比對(duì)余甘子果核多酚得率的影響Fig.3 Effect of solid and liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)余甘子果核多酚得率的影響

余甘子果核多酚得率隨著提取時(shí)間的增加先升高后降低，超聲提取20 min對(duì)應(yīng)的余甘子果核多酚得率最大6.19%，此時(shí)繼續(xù)增加提取時(shí)間則部分多酚物質(zhì)被氧化耗損或者被分解結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其得率降低[24]。因此，選取的最佳提取時(shí)間為20 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)余甘子果核多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel

2.2.5 提取溫度對(duì)余甘子果核多酚得率的影響

如圖5所示，隨著提取溫度的升高余甘子果核多酚得率先升高后降低，在50 ℃時(shí)多酚得率達(dá)到最高（6.98%）。原因是低溫不利于酚類物質(zhì)的溶出，但溫度較高會(huì)使部分多酚氧化和降解，導(dǎo)致多酚得率降低[25]。因此，選取的最佳提取溫度為50 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)余甘子果核多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基準(zhǔn)，按表1的因素水平L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化余甘子果核多酚提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2可知，影響余甘子果核多酚得率的因素主次順序?yàn)镈（提取溫度）＞A（丙酮體積分?jǐn)?shù)）＞B（料液比）＞C（提取時(shí)間），試驗(yàn)得到的余甘子果核多酚最佳提取工藝條件組合為A1B3C3D1，即丙酮體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度40 ℃及提取時(shí)間30 min。按上述的最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，余甘子果核多酚得率的平均值為7.37%。由表3可知，料液比和提取溫度對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

表2 余甘子果核多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polyphenols from Phyllanthus emblica L.kernel extraction technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.4 余甘子果核多酚的抗氧化性

2.4.1 余甘子果核多酚清除·OH的活性

由圖6可知，余甘子果核多酚對(duì)·OH的清除效果與樣品濃度呈正相關(guān)。余甘子果核多酚質(zhì)量濃度由1.0 mg/mL增大至3.0 mg/mL時(shí)，則對(duì)·OH的清除率由46.06%增大至84.44%，略小于同質(zhì)量濃度的VC對(duì)·OH的清除率，對(duì)應(yīng)的半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值（清除率達(dá)50%時(shí)所需的濃度）為1.2 mg/mL，表明余甘子果核多酚清除·OH效果較顯著，具有良好的抗氧化性。

圖6 余甘子果核多酚對(duì)·OH的清除效果Fig.6 Scavenging effect of polyphenols from Phyllanthus emblica L.kerenl on·OH

2.4.2 余甘子果核多酚清除DPPH·的活性

由圖7所示，隨著余甘子果核多酚濃度的不斷增大，對(duì)DPPH·的清除作用也逐漸增強(qiáng)，清除效果與多酚樣品濃度呈正相關(guān)。當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為80.53%（同濃度VC對(duì)DPPH·的清除率為97.07%），表明余甘子果核多酚具有一定的抗氧化性。

3 結(jié)論

經(jīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到超聲波輔助法提取余甘子果核多酚的最佳提取工藝條件為丙酮70%、1∶40（g∶mL）料液比、提取溫度40 ℃及提取時(shí)間30 min，對(duì)應(yīng)多酚的得率為7.37%。

余甘子果核多酚的濃度越大，清除·OH及DPPH·的效果越顯著，清除能力與多酚樣品濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系，且對(duì)·OH的清除作用較強(qiáng)。當(dāng)余甘子果核多酚質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)84.44%，IC50值為1.2 mg/mL。結(jié)果表明余甘子果核多酚具有良好的抗氧化活性，可開(kāi)發(fā)作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域。后續(xù)可采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)余甘子果核多酚物質(zhì)做進(jìn)一步的分離純化，并深入探究余甘子果核多酚的抗氧化活性與各有效成分之間的量效關(guān)系，為余甘子果核的合理開(kāi)發(fā)和深加工提供依據(jù)。