蔣思峽，王士超，胡鵬剛

（1.茅臺學院 食品科學與工程系，貴州 仁懷 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564507；3.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

藍莓果實中含有大量果膠、微量元素、原花青素等，營養(yǎng)價值較高，可鮮食，也非常適應用于制作成保健果酒[1-5]。藍莓酒按其釀制方法大致可分為發(fā)酵型和配制型。發(fā)酵型藍莓酒是指完全由藍莓原果經(jīng)破碎、壓榨取汁，經(jīng)酵母菌酒精發(fā)酵而成。配制型藍莓酒以發(fā)酵酒或蒸餾酒為酒基，將藍莓果實或果皮等浸泡其中，或者按一定比例將果汁、香精、色素、甜味輔料等調配而成，特點是色澤鮮艷，果香好，制做方法簡單，成本低[6-7]。

原花青素（proanthocyanidins，PAs）是一種以黃烷-3-醇作為結構單元，通過C-C鍵聚合而成的多酚類化合物，廣泛存在于自然界多種植物中，尤其藍莓、葡萄、松樹皮等植物含量較多[8]。據(jù)資料顯示原花青素中的抗氧化性核心成分為低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC），擁有極強的抗氧化能力，研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)抗氧化、清除自由基能力相當于維生素C的20倍、維生素E的50倍[9]。還具有調節(jié)人體新陳代謝、抗腫瘤、抑菌抗炎、預防血液擴張、動脈硬化、抑制α-淀粉酶活性，降低攝入體內(nèi)的葡萄糖吸收率，減輕體質量等功效[10-13]。以其穩(wěn)定、無毒、天然等優(yōu)點被廣泛用于食品、醫(yī)藥、保健、日化等方面[14-15]。近年來，原花青素對人體健康潛在生物活性受到廣泛關注，目前對提取原花青素的研究以葡萄籽、葡萄皮渣、黑枸杞、花生紅衣為原料較多，提取方法有多種，如酶法、溶劑法、超聲輔助法、微波輔助法、超聲波微波聯(lián)用法、超臨界流體萃取法等[16-20]。劉振華等[21]以乙醇為提取劑優(yōu)化黑枸杞中花青素提取工藝時最大提取率為0.424%；張曉靜等[22]利用微波輔助乙醇溶劑提取釀酒葡萄籽中的花青素時最大提取率為5.09%；陳麗媛等[23]在用超聲波提取紫玉米芯中花青素時，最大提取率為4.623 mg/g，研究發(fā)現(xiàn)提取體積分數(shù)70%丙酮水溶液為最好溶劑。但在食品工業(yè)中則要求所用溶劑必須無毒且終產(chǎn)物純度高[24]。乙醇提取法設備要求低，工藝簡單，無毒，故適合于食品工業(yè)。

該研究采用乙醇提取法提取配制型藍莓酒（以下簡稱藍莓酒）中原花青素，通過單因素及響應面試驗優(yōu)化提取工藝，旨在通過優(yōu)化藍莓酒中原花青素提取工藝條件，為下一步提高藍莓酒穩(wěn)定性研究奠定基礎，為推動藍莓酒的研究及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓酒（12%vol）：市售；鹽酸、甲醇、正丁醇、體積分數(shù)為99.5%乙醇（均為分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；石油醚（分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；原花青素（色譜級）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204TE分析天平：Mettler toledo國際貿(mào)易有限公司；KW-1000DC電子恒溫水浴鍋：江蘇中大生物科技集團有限公司；RE5220旋轉蒸發(fā)器：上海壘固儀器有限公司；TDL-5-A GENESYS 10S紫外分光光度計：美國Thermo公司；CH-250超聲波清洗機：北京創(chuàng)新德超聲電子研究所；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；LC-10N-50A真空冷凍干燥機：力辰科技公司；JJ-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取工藝優(yōu)化單因素試驗[25]

取一定量藍莓酒，將石油醚按照藍莓酒4倍體積加入，室溫浸泡1 d，過濾、抽真空、濃縮，干燥后備用。按照不同的乙醇體積分數(shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、提取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、料液比（1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9（g∶mL））、時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min），對干燥得到的產(chǎn)物進行提取，然后再在真空條件下濃縮、洗脫、干燥即得原花青素提取物。初始提取條件：提取溫度50 ℃，時間60 min，料液比1∶8（g∶mL），樣品質量1 g。

1.3.2 原花青素含量測定

稱取待測樣品1 mg加入甲醇溶液在棕色容量瓶中定容至10 mL后搖勻，移取稀釋液1 mL，以空白調零，參照文獻[26]測量吸光度值并計算樣品中原花青素含量。原花青素得率計算公式如下：

其中：w為原花青素得率，mg/g；c為提取液中原花青素質量濃度，mg/mL；v為提取液體積，mL；m為藍莓酒樣品質量，g。

1.3.3 原花青素提取工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗基礎上，以藍莓酒中原花青素得率為評價指標，以乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為4個評價因素，采用Box-Behnken中心組合原理，以4因素3水平設計優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 藍莓酒中原花青素提取工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction porcess optimization of proanthocyanidins from blueberry wine

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析、方差分析，最終確定藍莓酒中提取原花青素的最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對原花青素得率的影響

由圖1可知，在乙醇體積分數(shù)為40%～70%時，原花青素得率與乙醇體積分數(shù)呈正比，在乙醇體積分數(shù)為70%時，原花青素得率達到最大值，繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，原花青素得率下降。藍莓酒中的色素、親脂成分、醇溶雜質等溶出量會增加，原花青素與這些物質會共同競爭乙醇-水分子，從而降低得率[27]。故原花青素提取最佳乙醇體積分數(shù)為70%。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of different ethanol volume fraction on oligomeric proanthocyanidins yield

2.1.2 料液比對原花青素得率的影響

由圖2可知，料液比在1∶5～1∶7（g∶mL）時，原花青素得率與料液比呈正比，繼續(xù)增加料液比，得率未出現(xiàn)明顯變化?？赡苁且驗樗{莓酒中原花青素含量相對有限，當料液比達到一定值后，溶液中的原花青素已完全溶解，故得率不再上升。故原花青素提取最佳料液比為1∶7（g∶mL）。

圖2 不同料液比對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of different different material-liquid ratio on oligomeric proanthocyanidins yield

2.1.3 提取時間對原花青素得率的影響

由圖3可知，在提取時間為20～50 min時，原花青素得率與提取時間呈正比，在50 min左右達到最大值。但繼續(xù)延長提取時間，得率下降，這可能是由于提取時間的延長，原花青素中富含的酚羥基基團易與其他物質發(fā)生氧化反應，從而降低了得率[28]。故原花青素最佳提取時間為50 min。

圖3 不同提取時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of different extraction time on oligomeric proanthocyanidins yield

2.1.4 提取溫度對原花青素得率的影響

由圖4可知，在提取溫度為30～50 ℃時，藍莓酒中原花青素得率隨著提取溫度升高而上升，50 ℃時，得率達到最大值，繼續(xù)升高溫度，得率反而下降，一方面可能是由于高溫很容易破壞原花青素結構；另一方面可能是由于藍莓酒中的其他化學物質在高溫條件下，增大了溶出率。故原花青素最佳提取溫度為50 ℃。

圖4 不同提取溫度對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of different extraction temperautre on oligomeric proanthocyanidins yield

2.2 響應面試驗分析

以乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為4個評價因素設計響應面試驗，藍莓酒中原花青素提取的響應面試驗設計與結果分析見表2，二次多項式模型方差分析見表3。

表2 藍莓酒中原花青素提取工藝優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface methodology for extraction process optimization of proanthocyanidins from blueberry wine

表3 二次多項式模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic polynomial model

續(xù)表

從表2可知，通過Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果分析，建立了多元回歸擬合模型，得到原花青素得率回歸方程：

由表3可知，在本次試驗所涉及的范圍內(nèi)，二次多項回歸模型P＜0.000 1，模型有極顯著差異，說明自變量和響應值存在的相關關系極顯著。失擬項P=0.747 3＞0.05，說明模型差異顯著，其他因素對該模型影響較小，誤差小，故得出該模型可以很好地反應出藍莓酒中原花青素得率與各因素之間的關系。從F值可得，四個因素對原花青素得率產(chǎn)生影響的主次排序依次為：提取時間＞提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞料液比。從方差分析可得知提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)對原花青素得率影響極顯著（P＜0.01），料液比對其影響不顯著（P＞0.05），提取時間與溫度之間的交互作用極顯著（P＜0.01），乙醇體積分數(shù)與提取時間之間的交互作用顯著（P＜0.05），乙醇體積分數(shù)與料液比、乙醇體積分數(shù)與提取溫度、料液比與提取時間以及料液比與提取溫度之間的交互作用均不顯著（P＞0.05）。

2.3 響應面最優(yōu)結果與試驗驗證

2.3.1 響應面試驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應面及等高線圖，探索各因素之間的交互作用對原花青素得率的影響，結果見圖5。

圖5 乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間交互作用對藍莓酒中原花青素得率影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on ethanol concentration,liquid to material ratio,extraction temperature and time on proanthocyanidins yield in blueberry wine

由圖5可知，乙醇體積分數(shù)與提取時間之間交互作用顯著（P＜0.05），提取時間與溫度之間交互作用極顯著（P＜0.01）；乙醇體積分數(shù)與料液比、乙醇體積分數(shù)與提取溫度、料液比與提取時間、料液比與提取溫度之間交互作用均不顯著（P＞0.05）。利用響應面分析預測了藍莓酒中原花青素的最優(yōu)提取工藝條件：提取時間為56.71 min，料液比為1∶7.18（g∶mL），乙醇體積分數(shù)為66.96%，提取溫度為55.08 ℃，原花青素得率理論值為4.97 mg/g。

2.3.2 驗證試驗

為了驗證模型預測最優(yōu)工藝條件的穩(wěn)定性和準確性，且便于實際操作，將提取條件修訂為提取時間57 min，料液比為1∶7（g∶mL），乙醇體積分數(shù)67.0%，提取溫度55 ℃的條件下進行3次重復平行性試驗，試驗結果分別為4.83 mg/g、4.74 mg/g、5.01 mg/g，平均原花青素得率實際值為4.86 mg/g。驗證結果與模型理論值相接近，從而表明該模型可以較好的預測藍莓酒中原花青素得率的提取工藝條件。

3 結論

該研究優(yōu)化藍莓酒中原花青素的提取工藝，以藍莓酒中原花青素為目標成分，采用乙醇提取法，從單因素試驗得出提取時間、提取溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)四個因素對藍莓酒中原花青素得率存在一定影響，以四因素三水平設計優(yōu)化試驗，通過響應面分析優(yōu)化及驗證試驗確定最優(yōu)提取工藝條件為：提取時間57 min，料液比1∶7（g∶mL），乙醇體積分數(shù)67.0%，提取溫度55 ℃，在此最佳條件下，原花青素平均得率為4.86 mg/g。