周曉元 羅潤齊 王俊潔 張宿榮 許曉明 楊 洋 葉曉光

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東廣州 510260

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KPn)，屬于兼性厭氧革蘭陰性菌，是腸桿菌科克雷伯菌屬中重要的菌屬之一,檢出率高，是醫(yī)院感染的重要致病菌之一[1-3]。其中產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-Lactamases，ESBLs)是主要的耐藥機(jī)制之一，產(chǎn)ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，能催化水解β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵滅活酶，對β-內(nèi)酰胺類抗生素包括霉素類、頭孢菌素類(1-4代)、氨曲南等單環(huán)酰胺類藥物均耐藥[4-5]，但隨著臨床上越來越多的革蘭陰性菌形成產(chǎn)ESBLs耐藥菌株，產(chǎn)ESBLs KPn對環(huán)丙沙星的耐藥率高達(dá)30%以上[6]，耐藥情況越發(fā)嚴(yán)重。尋找一種耐藥率低、副作用小的抑菌藥物單用或聯(lián)用喹諾酮類抗生素(Quinolones，F(xiàn)QNS)，改善產(chǎn)ESBLs KPn對喹諾酮類藥物的耐藥性，是迫在眉睫的任務(wù)。

鹽酸小檗堿(Berberine，Ber)，是國內(nèi)外研究都被視為一種抗菌藥物[7-9]，有研究報(bào)道[10-13]，Ber具有抑制耐藥金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌的生長及逆轉(zhuǎn)耐藥性，但 Ber聯(lián)用FQNS對產(chǎn)ESBLs KPn的治療研究相對較少，本研究測定Ber聯(lián)用3種FQNS：環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin，LVX)及加替沙星(Gatifloxacin，GAT)的體外抑菌作用，探討B(tài)er能否增加FQNS的抗菌活性、增強(qiáng)抑菌作用并測定外排泵系統(tǒng)acrA、acrB和tolC表達(dá)量情況，查看是否通過改變表達(dá)量而達(dá)到更好的抑菌效果，為臨床上產(chǎn)ESBLs KPn的治療提供新并有效合理的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 收集2019～2020年，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室血液、痰液、尿液等分離的臨床KPn標(biāo)本。經(jīng)過VITEK—AM60型全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)(法國bioMérieux)鑒定，剔除重復(fù)菌株，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，篩選出產(chǎn)ESBLs KPn 20株，分別命名為KPn1、KPn2、KPn3……KPn 20,ATCC700603肺炎克雷伯菌作為質(zhì)控菌，來源于廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 主要儀器 全自動細(xì)菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)(VITEK—AM60型)，HS-1300-U潔凈工作臺，細(xì)菌比濁儀，KS260水平搖床，Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計(jì)，iCycler 582BR型PCR 擴(kuò)增儀，RT-PCR系統(tǒng)(7500型)。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試驗(yàn)試劑 Ber標(biāo)準(zhǔn)品(上海原葉生物有限公司(≥98%純度))，CIP標(biāo)準(zhǔn)品、LVX標(biāo)準(zhǔn)品、GAT標(biāo)準(zhǔn)品(上海信然實(shí)業(yè)有限公司(≥99%純度))，MH瓊脂培養(yǎng)基、Yeast extract、Tryptone(英國OXOID公司)，溶菌酶(Sigma公司)、RNeasy Protect Bacteria Mini Kit(QIAGEN公司)，PrimeScript RT reagent Kit(Takara公司)，SYBR Select Master Mix reagent(Applied Biosystems公司)

1.2 方法

1.2.1 制備不同濃度的藥液 用電子分析天平稱取0.512 g Ber標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 ml無菌ddH2O，配置成5120μg/ml的Ber原液，經(jīng)過一次性過濾器過濾除菌，連續(xù)2倍稀釋[14]，分別配制成2560、1280、640 …… 0.3125μg/ml濃度的鹽酸小檗堿藥液。同理分別配制5120、2560、1280…… 0.3125μg/ml濃度的CIP、LVX及GAT藥液。

1.2.2 制備含藥MH瓊脂平板 將配制好的藥液按(藥液∶MH瓊脂=1∶ 9)比例加入平板中，總量20 ml，即加入遞減濃度的Ber、CIP、LVX或GAT藥液2 ml，MH瓊脂培養(yǎng)基18 mL。同樣的，如需兩藥聯(lián)用，按比例(Ber+CIP/LVX/GAT：MH瓊脂=1∶1∶8)配制總量20 ml的含藥MH平板，同時(shí)準(zhǔn)備空白MH瓊脂平板做對照。

1.2.3 測定單藥最低抑菌濃度(MIC) 采用微量稀釋法[15]，把不同濃度的Ber、CIP、LVX或GAT藥液加入至多根含MH培養(yǎng)液的無菌試管中，連續(xù)兩倍稀釋，藥液的終濃度為0.0625 μg/ml 至512 μg/ml，加入每管終濃度為1×105CFU/ml的菌液，3種空白對照管做參照(只含MH培養(yǎng)液、只含藥液與MH培養(yǎng)液、含菌液與培養(yǎng)液不含藥液)，放進(jìn)37°C恒溫培養(yǎng)16～18小時(shí)，肉眼見無渾濁的試管中，挑選出含最低藥液濃度的試管，此濃度是該藥液的MIC。

1.2.4 棋盤法測定兩藥聯(lián)用的MIC 采用微量棋盤法[12]，96孔微量板的橫坐標(biāo)按順序分別加入遞增二倍濃度的CIP、LVX或GAT藥液，縱坐標(biāo)加入同等要求的Ber藥液，均加入終濃度為1×105CFU/ml的菌液，測定Ber分別與CIP、LVX或GAT聯(lián)用時(shí)的MIC,同樣設(shè)定3種空白對照管做參照(同1.2.3)，放進(jìn)37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18小時(shí)，觀察各孔液體渾濁程度，同樣的挑選肉眼見無渾濁的孔，此濃度是兩藥聯(lián)用的MIC。

1.2.5 計(jì)算FIC指數(shù) 根據(jù)兩藥聯(lián)用的MIC,計(jì)算兩藥聯(lián)用時(shí)的FIC指數(shù)[16]，為兩藥聯(lián)用的相互作用提供依據(jù)。FIC指數(shù)=FIC甲藥+FIC乙藥=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。結(jié)果判讀：FIC指數(shù)>2，拮抗作用；1

1.2.6 殺菌曲線的測定并繪制 選取FIC指數(shù)為協(xié)同或相加作用的KPn 11、KPn 15繪制殺菌曲線圖型，實(shí)驗(yàn)分組：空白組(MH培養(yǎng)液+菌液)、Ber 512μg/ml組、1/4 MIC CIP+BER 128μg/ml組、1/4 MIC LVX+BER 128 μg/ml組、1/4 MIC GAT+BER 128 μg/ml組。每組終濃度菌液含量約為1×106CFU/ml，37 ℃恒溫培養(yǎng)，在0、1、2、4、6、8、12和24小時(shí)取樣10 μg至MH培養(yǎng)基中，均勻涂開后再次放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，觀察菌落數(shù)并換算log10CFU/ml，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌落數(shù)log10CFU/ml為縱坐標(biāo)繪制殺菌曲線圖形。

1.2.7 RT-PCR測定外排泵基因acrA、acrB和tolC的表達(dá)量

1.2.7.1 引物的設(shè)定 acrA-F:CAGTTTGTTTGTTGTGATCGCC;acrA-R:GCGTCTGTATGAAGGCATTATCC;acrB-F:GCAATCAGTGGAGATCAGCGT;acrB-R:CGGATGTAGTCGGATATATGGT;tolC-F:ATGTGGCTGGCCGAATACCT;tolC-R:TACGGTATAGCATACCGTGT;

1.2.7.2 RT-PCR測定 在1.2.6殺菌曲線測定過程中，實(shí)驗(yàn)組與對照組均在細(xì)菌的對數(shù)生長期，在分光光度計(jì)測定OD600約1.2數(shù)值時(shí)，分別取取約0.4 ml總液體加入0.8 ml RNA protect Reagent，離心，取沉淀物進(jìn)行RNA的提取，合成cDNA，以16S rRNA作為內(nèi)參對照,按要求上機(jī)行RT-PCR測定acrA、acrB和tolC的表達(dá)量，按2-△△CT方法分析。

2 結(jié)果

2.1 單用Ber、CIP、LVX或GAT的MIC值

20株KPn菌株單用Ber的MIC值>512 μg/ml為75%(15/20)，≤51 2μg/ml為25%(5/20)均對Ber耐藥，CIP、LVX或GAT的MIC值4-512 μg/ml，同樣的均對上述藥物耐藥(表1)。

表1 單用Ber、CIP、LVX或GAT對20株KPn的MIC值

2.2 聯(lián)用Ber和CIP、LVX或GAT的MIC值和FIC指數(shù)

20株KPn菌株聯(lián)用Ber+ CIP，CIP 的MIC值下降1倍為85%(17/20)，下降2倍或以上為15%(3/20)，無下降為0%(0/20)，Ber的MIC值值下降1倍為65%(13/20)，下降2倍或以上為35%(7/20)，無下降為0%(0/20)，F(xiàn)IC指數(shù)為協(xié)同作用15%(3/20)，相加作用75%(15/20)，無關(guān)作用10%(2/20)；聯(lián)用Ber+ LVX，LVX的MIC值下降1倍為70%(14/20)，下降2倍或以上為30%(6/20)，無下降為0%(0/20)，Ber的MIC值值下降1倍為60%(12/20)，下降2倍或以上為40%(8/20)，無下降為0%(0/20)，F(xiàn)IC指數(shù)為協(xié)同作用20%(4/20)，相加作用70%(14/20)，無關(guān)作用10%(2/20)；聯(lián)用Ber+ GAT，GAT的MIC值下降1倍為50%(10/20)，下降2倍或以上為50%(10/20)，無下降為0%(0/20)，Ber的MIC值值下降1倍為30%(6/20)，下降2倍或以上為70%(14/20)，無下降為0%(0/20)，F(xiàn)IC指數(shù)為協(xié)同作用50%(10/20)，相加作用50%(10/20)，無關(guān)作用10%(2/20)(表2、表3、表4)，聯(lián)用Ber和CIP、LVX或GAT，MIC值較單用時(shí)均有下降(P <0.05)，其中Ber與GAT聯(lián)用，MIC值下降幅度最大及下降的菌株數(shù)最多(P <0.05)，Ber和CIP、LVX聯(lián)用均呈現(xiàn)相加作用為主，但Ber和GAT聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同作用為主，表示兩藥聯(lián)用有更好的抗菌活性，能減少各自的抗菌濃度，Ber和GAT聯(lián)用更為明顯。

表2 聯(lián)用Ber與CIP對20株KPn的MIC值和FIC指數(shù)

表3 聯(lián)用Ber與LVX對20株KPn的MIC值和FIC指數(shù)

表4 聯(lián)用Ber與GAT對20株KPn的MIC值和FIC指數(shù)

2.3 Ber和CIP、LVX或GAT聯(lián)用對KPn殺菌曲線的影響

選取FIC指數(shù)為協(xié)同或相加作用的KPn 11、KPn 15制作殺菌曲線，見圖1、2。單用Ber 512μg/ml組、1/4 MIC CIP+BER 128μg/ml組和1/4 MIC LVX+BER 128μg/ml組在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(24h)與空白組相比，曲線均有所下降，但差異較小，能抑制細(xì)菌生長但效果不明顯；1/4 MIC GAT+BER 128μg/ml組與其余各組相比，殺菌曲線下降明顯，抗菌活性好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明GAT聯(lián)用BER抑菌效果最佳。

圖1 Ber和CIP、LVX或GAT聯(lián)用對KPn11殺菌曲線圖

2.4 RT-PCR測定Ber和CIP、LVX或GAT聯(lián)用對acrA、acrB和tolC表達(dá)量的影響

單用Ber 512 μg/ml組與空白組相比acrA、acrB和tolC表達(dá)量有3～5倍升高(P<0.05)，1/4 MIC CIP+BER 128 μg/ml組、1/4 MIC LVX+BER 128μg/ml組和1/4 MIC GAT+BER 128 μg/ml組空白組相比表達(dá)量明顯升高，15-19倍升高(P<0.05)，也明顯高于單用Ber 512 μg/ml組(P<0.05)，但1/4 MIC CIP+BER 128 μg/ml組、1/4 MIC LVX+BER 128μg/ml組和1/4 MIC GAT+BER 128 μg/ml組相比較，表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 Ber和CIP、LVX或GAT聯(lián)用時(shí)的acrA、acrB和tolC表達(dá)量

3 討論

KPn是條件致病菌，致病性強(qiáng),可引起嚴(yán)重的肺炎、顱內(nèi)感染、胃腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、皮膚傷口感染、敗血癥及其他全身性的感染[17]，是臨床上常見的病原菌。隨著臨床抗生素的廣泛使用、侵襲性檢查的增加、二重感染等等，在我國2017年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，產(chǎn)ESBLs KPn檢出率為27.4%[18]，治療相當(dāng)困難。FQNS是廣譜的殺菌藥物，特別是第三代喹諾酮類藥物，如CIP、LVX、GAT等，對大部分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有良好的抗菌活性，但隨著臨床上越來越多的革蘭陰性菌形成產(chǎn)ESBLs耐藥菌株，耐藥情況越發(fā)嚴(yán)重，是臨床治療上最迫不及待必須攻克的難題。

圖2 Ber和CIP、LVX或GAT聯(lián)用對KPn15殺菌曲線圖

我國是植物藥大國，研究發(fā)現(xiàn)[19-22]，多種植物藥物對KPn均有良好的抗菌活性。其中Ber，是一種從黃連中提取的異喹啉生物堿，分子式[C20H18NO4]+Cl-[23]，具有低毒、不易耐藥、抑菌作用強(qiáng)等特點(diǎn)的植物性抗菌藥物。

本研究通過聯(lián)用Ber和CIP、LVX或GAT對產(chǎn)ESBLs KPn的MIC值、FIC指數(shù)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用Ber后，均能使CIP、LVX或GAT的MIC值下降1倍以上，CIP、LVX主要呈現(xiàn)相加作用，GAT主要呈協(xié)同作用。這與既往研究[24-26]相似，Ber與抗生素聯(lián)用能達(dá)到協(xié)同或者相加的抑菌效果，從而提高抗生素的抗菌活性。提示單用Ber、CIP、LVX或GAT時(shí)，對產(chǎn)ESBLs KPn抑菌能力弱，均呈現(xiàn)耐藥狀態(tài)，但聯(lián)用Ber后可逆轉(zhuǎn)耐藥狀態(tài)，降低抗菌藥物的使用劑量，增強(qiáng)了抗菌藥物的抗菌活性，有效抑制產(chǎn)ESBLs KPn的生長，其中GAT聯(lián)用后的抑菌效應(yīng)最為明顯，為往后的聯(lián)合抗菌藥物的開發(fā)奠定有效基礎(chǔ)。

通過殺菌曲線觀察可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)用Ber時(shí)，分別加入只有聯(lián)用藥物MIC值1/4濃度的抗菌藥物時(shí)，GAT聯(lián)用組曲線下降最為明顯，觀察終點(diǎn)(24小時(shí))，產(chǎn)ESBLs KPn菌量最少，能有效抑制KPn生長，其他聯(lián)用組差異不明顯，表示當(dāng)抗菌藥物濃度不足時(shí)，Ber仍能增強(qiáng)GAT抗菌活性，達(dá)到協(xié)同抑菌效應(yīng)，強(qiáng)有效地抑制細(xì)菌生長。我們還發(fā)現(xiàn)，前6小時(shí)是CIP、LVX或GAT控制KPn生長的關(guān)鍵時(shí)間，細(xì)菌的對數(shù)生長期，是抗菌藥物能否起到應(yīng)有的抗菌效果、細(xì)菌生長能否受到有效抑制的關(guān)鍵時(shí)刻，如果最終有效抑制KPn生長，0～4小時(shí)菌量增加不明顯或有下降，并4～6小時(shí)菌量生長依然緩慢，如GAT聯(lián)用組，其他聯(lián)用組在4～6小時(shí)菌量瘋狂生長，最終不能抑制細(xì)菌生長，所以前6小時(shí)是治療的關(guān)鍵時(shí)刻。但單用Ber的觀察時(shí)間為前8小時(shí)，較前延長2小時(shí)，證明了單獨(dú)使用Ber抑菌作用起效較慢，抑菌作用較弱，但達(dá)到1/2 MIC濃度時(shí)能一定程度上抑制KPn的生長，不易耐藥。

Karaosmanoglu K[27]等指出，Ber有效抑制大腸埃希菌生長是因?yàn)槭蛊渫馀疟肁crEF基因表達(dá)量升高。而外排泵AcrAB與大腸埃希菌的AcrEF是同源[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，單用Ber一定程度上抑制KPn的生長，acrA、acrB和tolC表達(dá)量輕度升高。CIP、LVX或GAT與Ber聯(lián)用組表達(dá)量明顯升高，證明Ber加快了菌體內(nèi)外排泵的運(yùn)轉(zhuǎn)速度，快速把抗菌藥物泵出體外，但GAT與Ber聯(lián)用有明顯的抑菌效應(yīng)，與CIP、LVX聯(lián)用相比有較大的差異，在本研究的外排泵系統(tǒng)的表達(dá)中未能找到差異，表明Ber均能增加其他抗菌藥物的抗菌活性，并刺激外排泵系統(tǒng)把“有害物質(zhì)”泵出，從而達(dá)到減少菌內(nèi)抗菌藥物的劑量，能繼續(xù)繁殖。KPn存在多個(gè)耐藥位點(diǎn)，可能除外排泵系統(tǒng)外的表達(dá)量有差異性的變化，仍需進(jìn)一步深入研究。

Ber聯(lián)合喹諾酮類抗生素能有效抑制產(chǎn)ESBLs KPn的生長，減少抗生素的用量，減少耐藥率的發(fā)生，GAT與Ber聯(lián)用時(shí)抗菌作用最為明顯，為指導(dǎo)臨床產(chǎn)ESBLs KPn的用藥提供了重要的依據(jù)，但仍需進(jìn)一步深入明確其分子作用機(jī)理。