胡雅瓊，梁 答，陳新璐，陳 琳，白 俊，李洪利，尹崇高，鐘 偉

濰坊醫(yī)學(xué)院1病理學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外一科//矯形骨科，3醫(yī)學(xué)研究實驗中心，4護理學(xué)院，山東 濰坊261053

骨肉瘤是最常見于兒童和青少年患者的骨腫瘤，其特征是治療后轉(zhuǎn)移進展和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險［1］。由于患者的生存率較低，這種疾病有效的治療管理仍然是難以捉摸的［2］。為了實現(xiàn)更有效的治療管理方案，從而提高患者的生存率，在臨床環(huán)境中為骨肉瘤的治療確定更有針對性的治療方法至關(guān)重要［3］。

miRNA是小的內(nèi)源RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達，在各種細胞和生理過程（例如細胞增殖和分化）中發(fā)揮重要作用［4-6］。據(jù)報道它們的異常表達與各種人類腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有關(guān)的功能研究已被證實［7,8］，miRNA充當腫瘤抑制物或癌基因，并且針對miRNA的miRNA模擬物和分子已在臨床前開發(fā)中顯示出希望［9］。前期已有研究證明miR-671-5p能夠結(jié)合相關(guān)靶蛋白從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，能夠通過抑制成纖維生長因子受體2阻斷人食道鱗狀細胞癌的進展［10］。MiR-671-5p的過表達能夠影響結(jié)腸癌的預(yù)后，并會加速結(jié)腸癌細胞的增殖，遷移和侵襲［11］。另外，MiR-671-5p也能夠通過結(jié)合釉叢蛋白1在抑制骨肉瘤細胞生長、遷移和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。但是，miR-671-5p影響骨肉瘤發(fā)展進程的其他分子機制尚不明確。

在本研究中，我們研究了miR-671-5p在骨肉瘤中的作用，并探討了miR-671-5p與其下游靶基因SMAD3在體外的相互作用，結(jié)果表明，miR-671-5p通過結(jié)合其下游靶基因SMAD3影響骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

Lipofectamine 2000（Invitrogen），miR-671-5p上下游引物（上海生工生物工程有限公司），β-actin（ab8226）、SMAD3（ab40854）、Vimentin（ab92547）、N-cadherin（ab76001）抗體（Abcam）。

1.2 網(wǎng)上在線數(shù)據(jù)庫

NCBI在線數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中GSE28423 數(shù)據(jù)集篩選骨肉瘤細胞中差異表達的miRNAs，GSE70414數(shù)據(jù)集對骨肉瘤細胞中l(wèi)og2FC>1，P<0.05 的mRNA 進行篩選；starbase 數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）、miRDB數(shù)據(jù)庫（http://mirdb.org/）、TargetScan數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測可能與miR-671-5p結(jié)合的hub基因。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人成骨細胞hFOB1.19，骨肉瘤細胞MG63、U2OS、Saos-2，人胚胎腎細胞HEK293T均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC），并按照其培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，并在細胞達到0.70時通過Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中。細胞分組為：con（轉(zhuǎn)染過表達miR-671-5p對照質(zhì)粒的骨肉瘤細胞）；miR-671-5p（轉(zhuǎn)染過表達miR-671-5p質(zhì)粒的骨肉瘤細胞）；NC（轉(zhuǎn)染過表達SMAD3對照質(zhì)粒的骨肉瘤細胞）；SMAD3（轉(zhuǎn)染過表達SMAD3質(zhì)粒的骨肉瘤細胞）；SMAD3+miR-671-5p（共轉(zhuǎn)染過表達SMAD3和過表達miR-671-5p質(zhì)粒的骨肉瘤細胞）。

1.4 qRT-PCR

TRIzol 提取各組細胞的總RNA，ReverTra AceRQpcr RT Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，U6為內(nèi)參，運行條件為95 ℃30 s、95 ℃5 s、65 ℃30 s、72 ℃30 s、循環(huán)數(shù)為35，PCR 檢測細胞中miR-671-5p的表達情況。2-△△CT計算結(jié)果。miR-671-5p上游引物為：GCGCGCATAAAGTAGAAAGC；下游引物為：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；莖環(huán)結(jié)構(gòu)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACAGTAGT

1.5 Transwell實驗

將4×104具有不同miR-671-5p或SMAD3表達水平的骨肉瘤細胞分別接種在無FBS的MEM培養(yǎng)基中，并置于小室或鋪有Matrigel小室的上腔室中。然后，下腔注入10% FBS的MEM培養(yǎng)基。24 h后甲醇固定15 min，輕拭上室的細胞，Giemsa染色1 h，PBS清洗，吸棄PBS晾干后進行拍照。鏡下隨機選擇5個視野拍照，取其平均值作為最終結(jié)果。

1.6 Western blot

提取各組細胞的總蛋白，測量蛋白質(zhì)濃度，在10%SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，一抗4 ℃過夜，洗膜，二抗常溫孵育1 h，洗膜，顯影，曝光，分析灰度值，計算結(jié)果。抗體配制如下：SMAD3（1∶500），Vimentin（1∶1000），N-cadherin（1∶500），β-actin（1∶1000）作為內(nèi)參。

1.7 熒光素酶報告基因檢測

HEK293T細胞接種到24孔板中，并在細胞數(shù)量達到0.70時利用Lipofectamine 2000將miR-671-5p過表達質(zhì)粒及對照質(zhì)粒、SMAD3野生型SMAD3-3’UTRWt及突變型SMAD3-3’UTR-Mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后，檢測各組細胞的熒光素酶活性，分析相對熒光強度，計算結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組之間差異分析采用獨立樣本t檢驗，多樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-671-5p在骨肉瘤組織和細胞中表達下調(diào)

通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫獲得數(shù)據(jù)集GSE28423，篩選出|log2FC|>4 的miRNAs 并制作熱圖（圖1A），GSE28423數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)miR-671-5p的log2FC=-4.80、P<0.05，在骨肉瘤細胞中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)在10例骨肉瘤組織中，與癌旁正常骨組織相比，骨肉瘤組織中miR-671-5p的表達明顯降低（圖1B）。因此，我們選擇miR-671-5p作為研究對象。qRTPCR結(jié)果顯示與人成骨細胞hFOB1.19相比，在骨肉瘤細胞中miR-671-5p 的表達明顯下調(diào)（圖1C）。MiR-671-5p主要參與的前10位KEGG通路，包括Wnt信號通路、癌癥通路、細胞周期等，這些通路在癌癥中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此我們可以推測miR-671-5p也許參與相關(guān)通路的調(diào)控從而影響骨肉瘤的發(fā)展進程（圖1D）。

圖1 MiR-671-5p在骨肉瘤組織和細胞中表達下調(diào)Fig.1 MiR-671-5p expression is down-regulated in osteosarcoma tissues and cells.A:Heatmap of the differentially expressed miRNAs with |log2FC| >4 in the GSE28423;B:Expression of miR-671-5p in 10 patients with osteosarcoma (*P<0.05).C:Expression of miR-671-5p in osteosarcoma cells (*P<0.05 vs hFOB1.19 group).D:KEGG analyses of miR-671-5p.

2.2 MiR-671-5p抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲

將miR-671-5p過表達質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細胞，qRT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，過表達miR-671-5p組中miR-671-5p表達（MG63：P<0.0001；Saos-2：P=0.0002）明顯上調(diào)（圖2A）。Transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達miR-671-5p組穿膜細胞數(shù)（MG63：P=0.0017；Saos-2：P=0.0014）明顯減少（圖2B）。而Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達miR-671-5p 組穿膜細胞數(shù)（MG63：P=0.0124；Saos-2：P<0.0001）明顯降低（圖2C）。

圖2 MiR-671-5p對骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.2 Effect of miR-671-5p overexpression on migration and invasion of osteosarcoma cells.A:Expression of miR-671-5p in different groups after transfection.B,C:Transwell assay for examining cell invasion and migration abilities in each group(scale bar=100 μm).*P<0.05.

2.3 MiR-671-5p抑制骨肉瘤細胞的EMT的發(fā)生

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達miR-671-5p 組中Vimentin（MG63：P=0.0054；Saos-2：P=0.003）和N-cadherin（MG63：P=0.0138；Saos-2：P=0.0244）的表達明顯降低（圖3）。

圖3 Western blot檢測miR-671-5p對骨肉瘤細胞EMT的影響Fig.3 Western blotting for detecting expressions of EMT-related proteins in osteosarcoma cells overexpressing miR-671-5p.

2.4 SMAD3為miR-671-5p的關(guān)鍵基因

網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫starbase、miRDB、TargetScan預(yù)測可能與miR-671-5p結(jié)合的靶蛋白取其交集并獲取hub基因，構(gòu)建degree 得分前10 位的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖4A），將網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫預(yù)測的hub 基因與骨肉瘤數(shù)據(jù)集GSE70414 中l(wèi)og2FC>1，P<0.05 的mRNA 取交集（圖4B），發(fā)現(xiàn)SMAD3既在骨肉瘤中表達上調(diào)，又與miR-671-5p 結(jié)合。Western blot 檢測在骨肉瘤細胞中SMAD3的表達情況，發(fā)現(xiàn)與人成骨細胞hFOB1.19相比，SMAD3在骨肉瘤細胞中表達明顯上調(diào)（圖4C）。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與con/Wt-SMAD3-3’UTR組相比，miR-671-5p/Wt-SMAD3-3’UTR組的相對熒光活性明顯降低，而con/Mut-SMAD3-3’UTR組與miR-671-5p/Mut-SMAD3-3’UTR 組則無明顯差異（圖4D）。

圖4 SMAD3為miR-671-5p的關(guān)鍵基因Fig.4 SMAD3 is a key gene for miR-671-5p.A:Protein interaction network of the top10 target genes associated with miR-671-5p;B:Venn diagram of the hub genes and GSE70414.C:Expression of SMAD3 in osteosarcoma cells (*P<0.05 vs hFOB1.19 group).D:Relative luciferase activity in different groups measured by luciferase report experiment.*P<0.05.

2.5 MiR-671-5p調(diào)控SMAD3抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲

通過Western blot發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SMAD3組SMAD3 的表達（MG63：P=0.0006；Saos-2：P=0.0009）明顯升高，而SMAD3+miR-671-5p組SMAD3的表達（MG63：P=0.0008；Saos-2：P=0.0018）則少于SMAD3組（圖5A）。Transwell 遷移實驗發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，SMAD3 組穿膜細胞數(shù)（MG63：P=0.0006；Saos-2：P=0.0003）明顯升高，而SMAD3+miR-671-5p組的穿膜細胞 數(shù)（MG63：P=0.0018；Saos-2：P=0.0014）則少于SMAD3組（圖5B）。Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，SMAD3組穿膜細胞數(shù)（MG63：P=0.0003；Saos-2：P=0.0003）明顯升高，而SMAD3+miR-671-5p組的穿膜細胞數(shù)（MG63：P=0.0003；Saos-2：P=0.0034）則少于SMAD3組。

圖5 MiR-671-5p調(diào)控SMAD3抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲Fig.5 MiR-671-5p targets SMAD3 to inhibit the invasion and metastasis of osteosarcoma cells.A:Expression of SMAD3 in osteosarcoma cells in different groups.B:Transwell assay for examining migration and invasion abilities of cells transfected with the plasmids for overexpression of SMAD3,miR-671-5p,or both.scale bar=100 μm,*P<0.05.

3 討論

骨肉瘤的診療現(xiàn)在大多基于標準的選擇診療法，包括積極的手術(shù)切除、全身化療和靶向放療［13］。本文致力于找到新的腫瘤標志物和靶點治療，從而降低骨肉瘤的發(fā)展。目前有報道闡明，miRNA與骨肉瘤的化療敏感性和耐藥性有著密切相關(guān)性［14,15］。也有報道稱miRNA可能參與骨肉瘤的抗輻射并能夠降低放療的敏感性從而對其今后的治療起著非常重要的作用［16］。因此，探索miRNA的分子機制，找到新的腫瘤標志物和靶點治療對降低骨肉瘤的耐化學(xué)性，提高其對化療和放療的敏感性尤為重要。本文正是以此為切入點，通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫篩選出在骨肉瘤中相對表達下調(diào)的miR-671-5p作為研究對象。我們通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，過表達miR-671-5p后，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力降低，證實miR-671-5p可以作為一種抑癌基因在骨肉瘤的發(fā)展進程中發(fā)揮相應(yīng)的作用。前期研究表明多種miRNA的異常表達對骨肉瘤今后的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用［17-19］。MiR-627-3p可以通過靶向PTN降低骨肉瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力［20］。這為我們探索miR-671-5p在骨肉瘤的發(fā)展進程中如何發(fā)揮作用提供了思路。

EMT是一種可逆的細胞生物學(xué)程序，參與侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的化療耐藥［21］。本文通過Western blot實驗檢測在骨肉瘤中miR-671-5p對EMT的影響。在生理EMT過程中，上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程并且失去了與基底膜的連接等上皮表型使細胞獲得了較高的遷移與侵襲能力。在腫瘤細胞中，EMT受到來自腫瘤及其微環(huán)境的刺激，如生長因子和細胞因子的異常調(diào)節(jié)，導(dǎo)致遷移和侵襲表型［22-24］。本文已經(jīng)證明過表達miR-671-5p能夠抑制EMT的發(fā)生，而通過transwell遷移和侵襲實驗也證明miR-671-5p能夠抑制骨肉瘤的遷移和侵襲能力，這正與我們的預(yù)期結(jié)果相符合。在EMT期間，細胞間以及細胞與細胞外基質(zhì)間的相互黏連作用被重塑，從而導(dǎo)致上皮細胞彼此之間以及下層基底膜之間的分離，并激活了一個新的轉(zhuǎn)錄程序來促進間充質(zhì)的命運［25,26］。本研究通過western blot實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-671-5p質(zhì)粒后，骨肉瘤細胞中EMT的相關(guān)標志物Vimentin、Ncadherin的表達明顯降低，過表達miR-671-5p能抑制EMT的發(fā)生。

有文獻報道稱miR-139可以通過負向調(diào)控ROCK1的表達影響骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力［27］。本研究通過相應(yīng)的生物信息學(xué)和實驗證明miR-671-5p對骨肉瘤的遷移運動和侵襲能力具有一定的抑制作用，也進一步為miRNA對骨肉瘤今后的發(fā)展提供有力依據(jù)。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)SMAD3是miR-671-5p的關(guān)鍵基因，在骨肉瘤中表達上調(diào)。因此，我們把SMAD3作為后期研究對象。SMAD蛋白能夠介導(dǎo)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號傳導(dǎo)，通過多種機制對TGF-β超家族信號通路產(chǎn)生抑制作用，并在腫瘤的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著至關(guān)重要的角色［28-31］。在本研究中，熒光素酶報告基因檢測證實miR-671-5p 與SMAD3之間存在結(jié)合位點。通過Transwell實驗進一步探究miR-671-5p與SMAD3相互作用對骨肉瘤發(fā)展進程的影響，發(fā)現(xiàn)SMAD3可以促進骨肉瘤細胞的遷移運動和侵襲能力，而miR-671-5p則能夠抑制這種作用。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中miR-671-5p表達下調(diào)，抑制骨肉瘤EMT的發(fā)生，并且能夠通過負向調(diào)控SMAD3抑制骨肉瘤的遷移和侵襲能力，了解miR-671-5p 在骨肉瘤發(fā)展進程中的作用，將為后期miR-671-5p作為骨肉瘤潛在的治療靶點提供基礎(chǔ)，為未來骨肉瘤的治療提供新的理論依據(jù)。