仇欣霞，陳 荷，馮德龍，董為人

南方醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，3腫瘤研究所，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州510630

Smo是Sonic Hedgehog（Shh）的下游分子，是Shh信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)因子［1-2］。近期許多研究證實(shí)Smo與多種腫瘤細(xì)胞遷移有關(guān)，Smo抑制劑的小分子藥物是腫瘤治療的新靶點(diǎn)［3］。Shh信號(hào)通路負(fù)責(zé)維持胚胎的正常發(fā)育，在胚胎發(fā)育過程中對(duì)于調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和組織分化發(fā)揮重要作用［4-5］。此外，它還在軸突的生長(zhǎng)中起到了導(dǎo)向的作用［6］。但關(guān)于Smo蛋白調(diào)控干細(xì)胞增殖和遷移的作用沒有直接證據(jù)。由此我們推測(cè)，調(diào)控Smo的活性對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和遷移可能有影響，從而為神經(jīng)退行性疾病提供新的治療思路。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們將小分子藥物Purmorphamine（PM,Smo 的激動(dòng)劑）和Cyclopamine（CPM,Smo 的抑制劑）應(yīng)用于調(diào)節(jié)Shh信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究中，觀察他們對(duì)成年神經(jīng)干細(xì)胞（ANSCs）增殖、遷移的影響并探討可能的作用機(jī)制，旨在找尋一種能夠有效逆轉(zhuǎn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)程的新方法［7-8］。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液、Accutase消化液、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF-2）（Milipore）。Purmorphamine、Cyclopamine等試劑（MCE）。ABI 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI）。倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺(tái)（Airtech），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用實(shí)驗(yàn)室已購(gòu)買的成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（Milipore）。細(xì)胞培養(yǎng)方法參照實(shí)驗(yàn)室的前期工作，將凍存的成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞從液氮中取出，迅速置于37 ℃中水浴，解凍后將1 mL的細(xì)胞凍存液轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，緩慢加入9 mL 的培養(yǎng)液并混勻，離心1200 r/3 min。小心吸棄上清液，再加入10 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并補(bǔ)充20 ng/mL的FGF-2，種入經(jīng)多聚鳥氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。第2天全換液并補(bǔ)充FGF-2，以后隔天換液［9］。

1.3 細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)（CCK8實(shí)驗(yàn)）

ANSCs按密度為5×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL。將ANSCs隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、PM組和CPM組，每組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。參照相關(guān)文獻(xiàn)，選定PM和CPM的濃度范圍［10］。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定PM有效劑量為1.5 μmol/L，CPM有效劑量濃度為15 μmol/L。將處理后的細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，在0、24、48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前4 h，吸去細(xì)胞培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入100 μL CCK8混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用，繼續(xù)孵育4 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔的吸光度（A450nm）值。以時(shí)間（T）為橫軸，以光吸收值（A）為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ANSCs，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度稀釋至5×104/mL，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2.0 mL。用Marker筆沿著6 孔板直徑平行等距劃線，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h時(shí)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用200 μL 微量移液器的吸管垂直于定位橫線垂直方向均勻劃線，劃痕完畢后，用移液器緩慢吸出培養(yǎng)液，用不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次以除去細(xì)胞碎片及漂浮細(xì)胞，隨后加入無血清培養(yǎng)基2.0 mL。根據(jù)分組，在PM組和CPM組分別添加終濃度為1.5umol/L的PM或15 μmol/L的CPM，對(duì)照組僅加等量溶劑。所有培養(yǎng)孔在培養(yǎng)0，24，48 h時(shí)置于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，使用Image J 軟件打開圖片，測(cè)量劃痕面積。遷移面積An=空白面積A0-空白面積An。Cell migration index=（A0-An）/A0。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)

將對(duì)照組、PM組、CPM組及細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。以β-actin 為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)并合成PCR引物。

按說明書Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按20 μL 配置PCR 反應(yīng)體系，PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光閾值（Ct值），以2-△△Ct表示各因子相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 用于RT-PCR的引物序列Tab.1 Sequence of primers used in quantitative real-time PCR

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，用Image J軟件計(jì)算劃痕實(shí)驗(yàn)的面積，用GraphPad Prim8進(jìn)行圖表制作，計(jì)量資料的測(cè)定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smo調(diào)控ANSCs的增殖

相差顯微鏡下觀察可見各組的神經(jīng)干細(xì)胞均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多。PM組細(xì)胞增殖速度最快，而CPM組細(xì)胞增殖受到抑制。CCK8定量結(jié)果顯示，24 h時(shí)PM 組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖力有顯著性提高（P<0.05）；CPM組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖力無顯著性差異。48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，PM組和CPM組細(xì)胞增殖力均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），PM組細(xì)胞增殖力顯著提高（P<0.01），CPM 組細(xì)胞增殖力顯著降低（P<0.05）。

2.2 PM、CPM對(duì)ANSCs遷移的影響

培養(yǎng)至24 h，光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)照組、PM組和CPM組細(xì)胞劃痕的愈合程度，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞遷移指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。培養(yǎng)至48 h，與對(duì)照組比較，CPM組的細(xì)胞遷移指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而PM組細(xì)胞劃痕面積縮小，遷移指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖1 PM、CPM對(duì)ANSCs增殖的影響Fig.1 Effect of PM and CPM on proliferation of ANSCs in vitro.A:Microscopic observation of ANSCs treated with PM or CPM for 24 and 48 h(Original magnification:×100).B:Cell proliferation detected by CCK8 assay(*P<0.05,**P<0.01 vs control group).

圖2 PM、CPM對(duì)ANSCs遷移的影響Fig.2 Wound healing assay for assessing migration ability of ANSCs treated with PM or CPM for 24 and 48 h (A;×100) and quantitative analysis(B;*P<0.05,**P<0.01 vs control group).

2.3 PM 上調(diào)Smo 的表達(dá)以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)導(dǎo)向因子（Slit1）的表達(dá)

按上述分組將細(xì)胞培養(yǎng)48h，RT-qPCR方法檢測(cè)各組ANSCs中的G蛋白偶聯(lián)受體Smoothened（Smo）、細(xì)胞表面Patched蛋白（Ptch1）、轉(zhuǎn)錄因子（Gli1）表達(dá)量。結(jié)果顯示，PM組與對(duì)照組比較，Smo、Ptch1、Gli1因子顯著增高（P<0.05）。與對(duì)照組、CPM 組比較，PM 組ANSCs中的BDNF及Slit1的表達(dá)也顯著增高。

3 討論

圖3 各組細(xì)胞中Smo、Patch1、Gli1、BDNF、Slit1的表達(dá)水平Fig.3 Expression of Smo,Patch1,Gli1,BDNF and Slit1 mRNAS in ANSCs treated with PM or CPM for 48 h detected by qRT-PCR(*P<0.05).

近年來神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率逐年上升，有研究表明在成年甚至老年大腦的海馬和齒狀回等區(qū)域仍然分布少量的成年神經(jīng)干細(xì)胞。但是ANSCs數(shù)量有限且多處于靜息狀態(tài)，如何促進(jìn)ANSCs增殖并從海馬和齒狀回遷移到損傷區(qū)對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病治療有非常大的意義［11-12］。Smo蛋白是Shh信號(hào)通路的核心組成成員，能夠?qū)獾腟hh信號(hào)轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)的Gli信號(hào)，啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄從而激活Shh信號(hào)通路［13］。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞遭受神經(jīng)毒素?fù)p害以后，Shh蛋白通過Smo的上調(diào)激活Shh信號(hào)通路可以促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)［14-15］。在帕金森動(dòng)物模型中，紋狀體內(nèi)注射Shh蛋白可以減輕其行為損害［16］。也有研究表明Shh 作為干細(xì)胞激活因子在組織損傷中積極分泌，受刺激的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜去除術(shù)動(dòng)物模型中顯示出明顯增強(qiáng)的分化和遷移能力［17］。但關(guān)于Smo對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性變中的成年神經(jīng)干細(xì)胞遷移的調(diào)控作用鮮有報(bào)道。有研究表明在實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)，Smo基因組突變會(huì)導(dǎo)致Smo及下游通路異常激活，從而改善腫瘤微環(huán)境、促進(jìn)血管生成，并在腫瘤遷移中發(fā)揮促癌作用［18-19］。諸多Smo抑制劑的小分子藥物在臨床前實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)在治療某些惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移方面相對(duì)有效，其中兩種口服活性藥物已被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期腫瘤［20］。使用Smo抑制劑的臨床試驗(yàn)的數(shù)量之多突出了Smo在癌癥中的藥理靶向性的重要性［21-22］。由此我們聯(lián)想到在神經(jīng)系統(tǒng)退行性變中，Smo激動(dòng)劑也可以激活Shh信號(hào)通路，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及遷移。從CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Smo激動(dòng)劑PM能顯著促進(jìn)ANSCs的增殖，同時(shí)也可以促進(jìn)ANSCs的遷移。在阻斷Smo信號(hào)通路后，上述結(jié)果均被逆轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，證明了調(diào)控Smo的活性可以影響ANSCs的增殖和遷移。進(jìn)一步地，我們揭示促進(jìn)ANSCs增殖和遷移的可能的作用機(jī)制。

BDNF 屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，許多研究發(fā)現(xiàn)BDNF能夠促進(jìn)發(fā)育過程中的神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化及增殖，BDNF及其受體TrkB在皮質(zhì)的ANSCs遷移過程中起著重要的作用［23-24］。不僅如此，它還可以促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)［25-26］。坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中，在靠近損傷部位的雪旺細(xì)胞中誘導(dǎo)BDNF基因表達(dá)之前，Shh表達(dá)是上調(diào)的，繼續(xù)給予Smo抑制劑CPM可以抑制BDNF的表達(dá)［27］。我們的實(shí)驗(yàn)研究中，給予Smo激動(dòng)劑PM后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的BDNF的基因水平是顯著提高的，提示BDNF與Smo的調(diào)控有關(guān)。Slit1是多功能導(dǎo)向分子，它不僅具有調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)方向、引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞遷移等功能，而且最近的研究還發(fā)現(xiàn)Slit1在血管生成、腫瘤細(xì)胞遷移等多個(gè)過程中也發(fā)揮作用［28-29］。成年期，Shh是一種化學(xué)吸引因子，參與了神經(jīng)干細(xì)胞遷移的自主調(diào)節(jié)。Smo去除與神經(jīng)干細(xì)胞遷移失敗有關(guān)，推測(cè)可能是由神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)slit1配體的引入引起的間接效應(yīng)［30-31］。我們的實(shí)驗(yàn)研究中，給予Smo激動(dòng)劑PM后，ANSCs出現(xiàn)了顯著的增殖和遷移，進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)BDNF和Slit1基因水平顯著升高，提示PM可以激動(dòng)Smo并促進(jìn)ANSCs的增殖和遷移，它的作用機(jī)制可能與激活Smo促進(jìn)BDNF和Slit1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

使用Smo的激動(dòng)劑和抑制劑在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能夠調(diào)節(jié)ANSCs的增殖和遷移，未來仍需進(jìn)一步研究其在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?cè)隗w實(shí)驗(yàn)的作用。