李志陽，梁 丹，肖雅文，代云莉，艾福軍，丁 菁，石明雋，肖 瑛，郭 兵

貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室//貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550025

糖尿病腎?。―KD）是終末期腎病的主要病因［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止至2017 年全球糖尿病患者超過4.25 億人。如果不采取干預(yù)措施，到2045年，全球患糖尿病的人數(shù)估計(jì)將上升至6.29億［2］。而DKD是糖尿病的常見并發(fā)癥和死亡原因［3］。近年研究認(rèn)為腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂是其主要發(fā)病機(jī)制［4-8］。同時(shí)，炎癥在DKD 的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用［9-12］。氧化苦參堿（OMT）是苦參中含量最高的生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗腫瘤、抗纖維化等作用，廣泛用于慢性乙型肝炎的治療及肥胖、糖尿病等相關(guān)疾病的輔助用藥［13-14］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OMT對糖尿病大鼠腎組織的炎癥反應(yīng)和纖維化均具有一定抑制作用［14-16］。細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶（CHK）包括CHK1、CHK2，是G2/M期細(xì)胞周期檢測點(diǎn)調(diào)控及DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵分子，能夠阻止發(fā)生DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂并協(xié)調(diào)參與DNA修復(fù)的各個(gè)過程［17-18］。既往研究多集中于CHK1和CHK2與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，特別是在胃癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、血液腫瘤等腫瘤中CHK1和CHK2扮演著重要角色［19-23］。也有研究發(fā)現(xiàn)CHK1、CHK2可促進(jìn)IL-1β和IL-6的分泌從而引起炎癥反應(yīng)，提示CHK1和CHK2可能與炎癥和纖維化密切相關(guān)［24-25］，但關(guān)于CHK1和CHK2可否成為OMT治療DKD的主要靶點(diǎn)的研究目前尚未見報(bào)道，因此本研究旨在探究OMT對DKD抗炎抗纖維化的可能作用機(jī)制是否是通過影響CHK1 和CHK2 的表達(dá)來發(fā)揮的？為尋找OMT抗炎抗纖維化的有效靶點(diǎn)提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)8周齡SD雄性大鼠18只（北京華阜康有限公司）；大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞株（ATCC）。

1.1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma）；氧化苦參堿（南京廣潤生物制品有限公司）；β-肌動(dòng)蛋白（βactin）（普美生物科技有限公司）；兔抗纖維連接蛋白（FN）（abcam）；鼠抗Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）（Sigma）；兔抗Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；鼠抗CHK1（博奧森生物有限公司）；兔抗CHK2（abcam）；兔抗p-CHK1（Ser345）（Cell Signaling Technology）；兔抗p-CHK2（Thr68）（博奧森生物有限公司）；ELISA試劑盒（Elabscience）；正常糖培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（PBS）（常州天地人和公司）；CHK1-siRNA、CHK2-siRNA（吉瑪基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、糖尿病模型組（DM組）、氧化苦參堿治療組（OMT組）。DM組與OMT組尾靜脈注射STZ（55 mg/kg）復(fù)制糖尿病動(dòng)物模型。3 d后若血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型復(fù)制成功［17］。造模成功6周后，OMT組給予腹腔注射OMT 120 mg/kg，1次/d，NC組與DM組給予等量等體積生理鹽水，持續(xù)注射8周，每周監(jiān)測1次血糖、體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。所有操作均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求（1900073）進(jìn)行。

1.2.2 取材與生化指標(biāo)檢測 給藥8周后處死大鼠。處死前，代謝籠收集24 h尿并用試劑盒檢測尿蛋白；股動(dòng)脈取血，離心取血清；試劑盒檢測血糖、血肌酐，剩余血清置于-80 ℃保存待用；取雙側(cè)腎臟，部分固定于4%多聚甲醛溶液中用于組織切片，其余腎臟組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) NRK-52E細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的正常糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。OMT藥物用量根據(jù)本教研室前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)所得，為0.1 g/L。正常糖對照組（NG組）用1%NG培養(yǎng)（含1%胎牛血清的正常糖培養(yǎng)基，葡萄糖含量為5.5 mmol/L）；高糖模型組（HG組）用1%HG培養(yǎng)（含1%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，葡萄糖含量為30 mmol/L）；正常糖用藥組（NG+OMT組）與NG組處理方式相同，同時(shí)用0.1 g/L OMT干預(yù)24 h；高糖用藥組（HG+OMT組）與HG組處理方式相同，同時(shí)用0.1 g/L OMT 干預(yù)24 h；正常糖空載組（NG+con 組）用含1%NG 培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染陰性對照control-siRNA、正常糖敲低組（NG+siCHK1/2）用1%NG培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染CHK1/2-siRNA、高糖空載組（HG+con組）用1%HG 培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染陰性對照control-siRNA、高糖敲低組（HG+siCHK1/2）用1%HG培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染CHK1/2-siRNA。

1.2.4 腎組織HE染色、Masson染色 按試劑盒說明書操作。

1.2.5 ELISA 檢測腎組織勻漿IL-6、IL-1β的水平 按BCA試劑盒說明書操作檢測上清中蛋白濃度。ELISA試劑盒所測得IL-6、IL-1β濃度與上清中蛋白濃度之比為有意義值。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織中CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、蛋白的表達(dá)部位 采用SP二步法，將組織切片行脫蠟、水化、微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；30 mL/L H2O2去離子水孵育，一抗CHK1（1∶100）、CHK2（1∶100）、p-CHK1（1∶100）、p-CHK2（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后，加相應(yīng)二抗孵育，DAB顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、封片，光鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western blot 法檢測腎組織CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、FN、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ蛋白的表達(dá)水平取腎組織0.1 g，研磨后取上清。按BCA試劑盒說明書操作檢測濃度，按比例加入5×的上樣緩沖液，煮沸后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶封閉。TBST洗膜后，分別加β-actin（1∶5000）、CHK1（1∶1000）、CHK2（1∶1000）、p-CHK1（1∶1000）、p-CHK2（1∶1000）、FN（1∶1000）、Col-Ⅲ（1∶1000）、Col-Ⅳ（1∶1000）。4 ℃冰箱，搖床上孵育過夜；洗滌后分別加入相應(yīng)的二抗標(biāo)記物，室溫孵育1 h；用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon凝膠成像，經(jīng)Image J軟件分析后得到灰度值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，各組間數(shù)據(jù)的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。經(jīng)單因素方差分析，方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；若方差不齊時(shí)，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OMT對各組大鼠生化指標(biāo)的影響

與NC組相比，DM組大鼠血糖（BG）、血肌酐（Scr）和24 h尿蛋白（24 h UP）均明顯升高（P<0.05），經(jīng)OMT治療8周后，與DM組大鼠相比血糖、血肌酐和24 h尿蛋白均有所改善，但血糖仍未降至正常（P<0.05，表1）。

表1 各組大鼠血糖、血肌酐、24 h尿蛋白變化Tab.1 Changes of blood glucose,serum creatinine and 24 h urinary protein in each group(n=6,Mean±SD)

2.2 腎組織病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色可見，NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整；與NC組相比，DM組腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小管萎縮，小管間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤；與DM組相比，OMT組腎小球和腎小管病變程度明顯減輕。Masson染色可見，與NC組相比，DM組腎小管間質(zhì)膠原纖維增多；與DM組相比，OMT組膠原沉積顯著降低（圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟病理學(xué)變化Fig.1 HE and Masson staining for examining pathological changes of the kidney in each group(Original magnification:×400).Yellow arrows indicate the lesion site.

2.3 OMT對各組大鼠腎組織上清中炎癥介質(zhì)分泌的影響

DM組大鼠腎組織上清中IL-1β、IL-6的表達(dá)明顯高于NC組（P<0.05）。給予OMT治療8周后，與DM組相比IL-1β、IL-6的表達(dá)有所下降（P<0.05，表2）。

表2 各組大鼠腎組織上清中IL-1β、IL-6的表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of IL-1β and IL-6 in the renal tissue of the rats in each group(n=6,Mean±SD)

2.4 CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2在大鼠腎組織蛋白中的定位及表達(dá)情況

NC 組大鼠的腎組織中，與DM 組、OMT 組相比CHK1、CHK2表達(dá)量無明顯差異，但p-CHK1、p-CHK2表達(dá)量減少，DM組可見p-CHK1、p-CHK2表達(dá)明顯增多，主要表達(dá)在腎小管胞漿和細(xì)胞核中，呈棕黃色，腎小球也可見少量陽性染色；而在OMT組中，p-CHK1、p-CHK2的表達(dá)較DM組明顯減少，顏色變淺（圖2）。

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測各組大鼠腎組織CHK1/2、P-CHK1/2的表達(dá)Fig.2 Expression of CHK1/2 and p-CHK1/2 in renal tissue of rats in each group detected by immunohistochemical staining(×400).Red arrows indicate positive expression.

2.5 Western blot檢測各組大鼠腎臟中Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白的表達(dá)情況

與NC組相比，DM組Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明顯增加（P<0.05）；與DM組相比，OMT組Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠腎組織中Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白表達(dá)Fig.3 Col-III,Col-IV and FN protein expressions in the renal tissue of the rats in each group(n=6, Mean±SD).A:Western blots;B:Relative protein expression.*P<0.05 vs NC;#P<0.05 vs DM.

2.6 Western blot 檢測各組大鼠腎組織中CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2蛋白的表達(dá)情況

在NC組、DM組和OMT組中CHK1、CHK2蛋白水平統(tǒng)計(jì)無差異。與NC組相比，DM組p-CHK1、p-CHK2蛋白水平明顯增加（P<0.05）；與DM組相比，OMT組p-CHK1、p-CHK2蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖4）。

圖4 各組大鼠腎組織中CHK1、CHK2蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of CHK1 and CHK2 proteins in the renal tissue in each group(n=6,Mean±SD).A:Western blots;B:Relative protein expression.*P<0.05 vs NC;#P<0.05 vs DM.

2.7 敲低CHK1、CHK2后高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)的影響

當(dāng)CHK1/2敲低后，NG+siCHK1/2組各蛋白表達(dá)與NG+con 組相比無明顯差異，與NG+con 組相比，HG+con組p-CHK1/2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明顯增加（P<0.05）；與HG+con組相比，HG+siCHK1/2組各蛋白水平明顯減少（P<0.05，圖5）。

圖5 敲低CHK1、CHK2高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)Fig.5 Effects of CHK1 and CHK2 knockdown on protein expressions in NRK-52E cells exposed to high glucose(n=6,Mean±SD).A:Western blots of the proteins in cells with CHK1 knockdown.B:Protein expression of p-CHK1 relative to CHK1.C:Relative protein expression.D:Western blots of the proteins in cells with CHK2 knockdown.E:protein expression of p-CHK2 relative to CHK2.F:Relative protein expression.*P<0.05 vs NG,#P<0.05 vs HG.

2.8 OMT對高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)的影響

與NG 組相比，HG 組p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN 蛋白水平明顯增加（P<0.05），但CHK1、CHK2 蛋白水平無明顯變化。在所有組中CHK1、CHK2表達(dá)水平無明顯差異。與NG組相比，NG+OMT組各蛋白表達(dá)無明顯差異，HG組p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白水平明顯增加（P<0.05）；與HG組相比，HG+OMT組蛋白水平明顯減少（P<0.05，圖6）。

圖6 OMT對高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)的影響Fig.6 Effect of OMT on protein expressions in NRK-52E cells cultured with high glucose (n=6, Mean±SD).A,B:Western blots.C:Relative protein expression.*P<0.05 vs NG.#P<0.05 vs HG.

3 討論

DKD是糖尿病患者最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因［1］。近年來炎癥一直是調(diào)節(jié)DKD過程重要的研究熱點(diǎn)，廣受學(xué)者關(guān)注。多位作者分別從炎癥在DKD發(fā)展中的病理作用、表觀遺傳學(xué)對炎癥和纖維化的治療策略、表觀遺傳學(xué)與炎癥的關(guān)系等方面進(jìn)行綜述［9，11,26］。當(dāng)機(jī)體受到炎癥持續(xù)刺激后，腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），此時(shí)產(chǎn)生大量的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白形成肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞大量增殖，分泌纖維FN和Ⅰ-Ⅳ型膠原，造成過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最后形成纖維化病變［16,28-29］。高糖誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)了HK-2細(xì)胞的IL-1β分泌、caspase-1激活和細(xì)胞凋亡，且在高糖條件下，CD36、NLRP3 和IL-1β 表達(dá)水平（蛋白質(zhì)和mRNA）均顯著增加［27］。α-硫辛酸可下調(diào)糖尿病大鼠腎組織TLR4 和NLRP3炎癥信號(hào)，減少炎性因子IL-6和TNF-α的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而減輕DKD炎癥反應(yīng)和纖維化病變的發(fā)生發(fā)展［29］。CHK1、CHK2是細(xì)胞周期檢測點(diǎn)調(diào)控的關(guān)鍵因子。當(dāng)機(jī)體受到多種內(nèi)源性或外源性因子的威脅而發(fā)生DNA 損傷時(shí)，CHK1、CHK2 可使DNA 復(fù)制停滯在G2/M 期，進(jìn)而引起一系列反應(yīng)［22］。Xu等［24］在PM2.5引起的人支氣管上皮細(xì)胞氣道炎癥與自噬的研究中提到了CHK1及其相關(guān)通路可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生從而上調(diào)IL-6和IL-1β的水平；人碳酸酐酶Ⅱ復(fù)制的衰老模型中發(fā)現(xiàn)CHK2可促進(jìn)IL-6等炎性因子的分泌［25］。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHK1/2在糖尿病大鼠腎組織中呈高表達(dá)，同時(shí)IL-6和IL-1β也呈高表達(dá)，提示在DKD中CHK1/2仍可能是促進(jìn)IL-6和IL-1β分泌的主要因素，即CHK1/2可能是導(dǎo)致DKD炎癥的重要因素。

OMT被普遍認(rèn)為具有抗炎、抗纖維化、抗病毒、抗心律失常和抗腫瘤等廣泛的藥理作用，目前被作為治療糖尿病的輔助用藥［13,14］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OMT具有顯著地抗腎纖維化作用，其機(jī)制可能與下調(diào)DKD腎組織中促纖維化因子TGF-β1表達(dá)和抑制Arkadia泛素化降解SnoN蛋白，促進(jìn)SnoN蛋白水平的恢復(fù)進(jìn)而抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的致纖維化效應(yīng)相關(guān)［14］。OMT也可通過將Id2與Twist結(jié)合并影響其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)Id2逆轉(zhuǎn)EMT并在糖尿病腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)揮抗纖維化作用［15］。此外，OMT可抑制高糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和致纖維化作用。其機(jī)制可能與OMT降低血糖抑制PKCα的信號(hào)激活，減少TLR4蛋白表達(dá)進(jìn)而使腎組織局部炎癥因子的分泌減少，從而緩解

DKD纖維化病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［16］。本研究結(jié)果中OMT的抗炎抗纖維化作用與上述報(bào)道一致，不同之處在于我們觀察到CHK1/2除作為細(xì)胞周期阻滯的關(guān)鍵激酶外，可能還參與了炎癥在DKD中的發(fā)生發(fā)展，可能是OMT減輕DKD炎癥和纖維化的新作用靶點(diǎn)。且在體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分我們看到，高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中CHK1/2磷酸化水平上升，纖維化指標(biāo)增多，敲低CHK1/2后纖維化指標(biāo)減少，經(jīng)OMT處理后CHK1/2磷酸化水平降低，同時(shí)纖維化指標(biāo)降低，這提示OMT治療纖維化的中間靶點(diǎn)可能是CHK1/2。

綜上所述，OMT在糖尿病大鼠腎臟中發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用機(jī)制可能是通過抑制CHK1/2的磷酸化水平從而影響下游IL-1β、IL-6炎癥介質(zhì)釋放及細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多來發(fā)揮作用的。本研究立足于課題組前期對OMT治療DKD的作用機(jī)制的研究，尋找到OMT治療的新靶點(diǎn)CHK1/2，探究了OMT對糖尿病大鼠腎臟抗炎抗纖維化作用的可能機(jī)制是通過抑制CHK1/2磷酸化來發(fā)揮的，為尋找OMT的作用靶點(diǎn)提供新思路，同時(shí)為臨床應(yīng)用OMT治療DKD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)我們將深入探究OMT是如何作用于CHK1/2，尋找其具體分子機(jī)制，明確CHK1/2作為OMT的靶點(diǎn)是如何起到抗炎和抗纖維化的作用。