張逸寅，顧康生，張騰騰，李倩倩，汪倩玲，王慧

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)心理科，安徽 合肥 230022）

非霍奇金淋巴瘤是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，當(dāng)前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示全球范圍內(nèi)其發(fā)病率占全部惡性腫瘤的2.8%，死亡率占全部惡性腫瘤的2.6%[1]。在我國該病的發(fā)病及死亡率亦逐年升高，其中彌漫大B細胞淋巴瘤系非霍奇金淋巴瘤最常見的病理亞型。針對該病制訂個體化的診療策略受到了廣泛關(guān)注。目前臨床上，對于彌漫大B細胞淋巴瘤亟需找到可靠的可反映病情和治療療效的外周血腫瘤指標(biāo)。

熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）家族組成的一系列由熱休克或細胞應(yīng)激產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，可以預(yù)防細胞凋亡或錯誤構(gòu)象折疊。根據(jù)其分子量，熱休克蛋白家族可分為小HSP、HSP 60、HSP 70 和HSP 90。需要特別關(guān)注的是，HSP 家族與多種惡性腫瘤相關(guān)[2]。在這些HSP 中，HSP 90α 是一種與蛋白折疊、細胞內(nèi)性狀密切相關(guān)的分子伴侶，其還能在細胞外空間中調(diào)控腫瘤的生物學(xué)行為[3,4]。既往的研究顯示，HSP 90α 在肺癌[5]、胃癌[6]、骨腫瘤[7]、大腸癌[8]及胰腺癌[9]等惡性腫瘤中均是可靠的可反映病情變化與治療療效的外周血標(biāo)志物。而其在彌漫大B細胞淋巴瘤中的臨床價值尚未探明。

本研究通過分析彌漫大B細胞淋巴瘤患者外周血血漿熱休克蛋白90α 表達水平，了解其與疾病臨床病理特征的關(guān)系，進而闡明其在病情監(jiān)測及近期療效判斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料與治療隨訪方案

本研究獲得了安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。納入2018 年3 月至2020 年11 月期間于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科就診的彌漫大B細胞淋巴瘤患者60 例，收集治療前后患者的外周血標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn)包括：1、所有患者在參與本研究前均知情同意；2、所有患者均通過組織病理學(xué)檢查明確為彌漫大B細胞淋巴瘤診斷；3、所有患者系初診患者；4、所有患者的體力狀態(tài)和主要臟器功能可以耐受靶向或化學(xué)治療；5、主要的臨床病理特征信息相對完整。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：1、患者合并急性或未控制的傳染性疾??；2、患者合并嚴(yán)重的心腦血管疾病或風(fēng)濕?。?、患者存在多原發(fā)惡性腫瘤或診斷為其他的淋巴瘤病理類型。腫瘤分期按照2014 年版Lugano 分期的標(biāo)準(zhǔn)。收集到的臨床病理信息包括性別、年齡、分子分型、臨床分期、國際預(yù)后指數(shù)（International Prognostic Index，IPI）、B 癥狀、大腫塊、乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）、東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分和結(jié)外病變情況。

一線治療（化療/靶向聯(lián)合化療/靶向治療）按照病患主管醫(yī)師的建議和病患的知情同意實施。按照2014 年版Lugano 評效標(biāo)準(zhǔn)進行近期療效評價。共有四種評價結(jié)果，包括完全緩解（Complete Remission，CR）、部分緩解（Partial Remission，PR）、穩(wěn)定（Stable Disease，SD）和進展（Progressive Disease，PD）。CR 和PR 患者合計用來計算客觀反應(yīng)率（Objective Response Rate，ORR），CR、PR 和SD 患者合計用來計算疾病控制率（Disease Control Rate，DCR）。本研究對納入患者進行隨訪，隨訪截止時間為2020 年12 月1 日。

1.2 外周血收集與酶聯(lián)免疫吸附試驗

使用抗凝管收集患者治療前和治療后評估療效時的外周血標(biāo)本。通過離心沉淀從全血中分離血漿。商品化的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自山東煙臺普羅吉公司，按照試劑盒說明書要求檢測外周血漿中HSP 90α的水平。具體操作如下：分別向預(yù)先已加入HSP 90α 抗體的96 孔板中加入稀釋血漿標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品。將辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗HSP 90α 抗體加入孔中37℃孵育1 小時。同樣在37℃的條件下，通過向每孔中添加四甲基聯(lián)苯胺試劑A 和B 來觀察顯色反應(yīng)。通過添加終止試劑來結(jié)束反應(yīng)。用伯騰分光光度計在450納米處檢測光密度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定HSP90α 在血漿標(biāo)本中的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 軟件17.0 版和GraphPad 軟件6.0版進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用偏度和峰度系數(shù)法判斷淋巴瘤患者基線HSP 90α水平是否符合正態(tài)分布。使用Mann-Whitney U 檢驗評估HSP 90α水平與淋巴瘤患者臨床病理特征的關(guān)系。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)來比較本研究中涉及的外周血標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)性。Wilcoxon 配對秩和檢驗用來評價治療前后和一線治療失敗時HSP 90α水平的變化情況。統(tǒng)計量的顯著水平定為小于0.05。

2 結(jié)果

2.1 彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP 90α情況以及與臨床病理特征的關(guān)系

本研究共納入60 例彌漫大B細胞淋巴瘤患者。這些患者的臨床信息及病理特征見表1。

表1 彌漫大B細胞淋巴瘤患者不同臨床病理特征與HSP90α水平的關(guān)系

全部患者血漿HSP 90α水平所在范圍為27.11 ng/ml 至300.25 ng/ml，中位數(shù)為86.57 ng/ml。既往文獻通過受試者工作特征曲線顯示，區(qū)分不同類型癌癥患者與所有對照組人群HSP 90α的最佳診斷截斷值為69.19 ng/ml[10]。本研究中有65.00%的彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP90α的水平高于既往最佳診斷截斷值。針對患者基線HSP90α水平進行正態(tài)性檢驗，峰度系數(shù)和偏度系數(shù)分別為0.214 和3.256，提示HSP 90α水平不符合正態(tài)分布。在臨床病理特征中，彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP 90α的水平與Lugano 分期（P=0.017）（圖1a）、IPI 評分（P=0.015）（圖1b）、外周血LDH水平（P=0.001）（圖1c）、ECOG 評分（P=0.008）（圖1d）以及結(jié)外病變個數(shù)（P=0.005）（圖1e）存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，而HSP90α水平與性別、年齡、分子分型、有無B 癥狀和有無大腫塊未見統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。

圖1 彌漫大B細胞淋巴瘤患者關(guān)鍵臨床病理特征與HSP90α水平的統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)

2.2 彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP90α 和LDH的相關(guān)性

LDH 是彌漫大B細胞淋巴瘤患者IPI 評分的重要組成要素，通過Pearson 相關(guān)系數(shù)比較HSP90α 與LDH的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一患者中兩者之間呈顯著正相關(guān)（Pearson r=0.563，P<0.001）（圖2）。圖2 彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP90α 和LDH水平的相關(guān)性

2.3 HSP90α水平與彌漫大B細胞淋巴瘤患者一線治療近期療效的關(guān)系

所有納入的彌漫大B細胞淋巴瘤患者均接受了一線治療，病患接受的治療計劃見表2。

表2 彌漫大B細胞淋巴瘤患者的一線治療方案

全部的60 例彌漫大B細胞淋巴瘤患者均評估了接受一線治療的近期療效。其中，30 例患者達到CR，16 例患者達到PR，8 例患者PD，6 例患者處于SD。進一步分析，ORR 和DCR 分別是76.67%和86.67%。在獲得腫瘤客觀緩解的46 例患者中，評估療效時患者HSP90α水平較基線顯著下降（P<0.001）（圖3a）。與此同時，在獲得腫瘤控制的52 例患者中，評估療效時患者HSP90α水平同樣較基線時顯著下降（P=0.001）（圖3b）。

截止至隨訪結(jié)束時間，60 例患者中有18 例出現(xiàn)了疾病進展。本研究收集到這18 例彌漫大B細胞淋巴瘤患者初診時和一線治療失敗時HSP90α水平。值得關(guān)注的是，這些患者血漿HSP90α水平在一線治療失敗時較基線顯著升高（P=0.014）（圖3c）。

圖3 彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP90α水平在接受一線治療前后的變化情況

3 討論

針對腫瘤標(biāo)志物的研究始終是惡性腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點。彌漫大B細胞淋巴瘤通過腫瘤組織內(nèi)的CD10、Bcl-6 和MUM1 等蛋白的表達進行分子分型，已成為國際上預(yù)測患者生存和判斷預(yù)后的重要標(biāo)志[11]。通過外周血進行腫瘤標(biāo)志物檢測較利用腫瘤組織具有很多優(yōu)勢。主要包括取材方便，可動態(tài)實時監(jiān)測以及創(chuàng)傷較小。在彌漫大B細胞淋巴瘤領(lǐng)域，外周血LDH水平是目前公認(rèn)的可靠腫瘤指標(biāo)，可反映患者的病情和預(yù)后。而繼續(xù)開發(fā)彌漫大B細胞淋巴瘤的外周血標(biāo)志物成為關(guān)注熱點。HSP 90α 是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物，基礎(chǔ)機制研究發(fā)現(xiàn)其被分泌至腫瘤細胞外，進而參與對腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，同時其在外周血中可被檢測到[4]。在國內(nèi)，HSP 90α 首先被批準(zhǔn)作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志物進行病情監(jiān)測和預(yù)后判斷[12]。在彌漫大B細胞淋巴瘤領(lǐng)域，先前的動物試驗發(fā)現(xiàn)HSP 90 可與Bcl-6 形成復(fù)合體[13]，說明其可能是影響彌漫大B細胞淋巴瘤生物學(xué)行為的重要分子靶標(biāo)。近期的另一項研究發(fā)現(xiàn)，外周血漿HSP 90α水平有助于對非霍奇金淋巴瘤患者的預(yù)后進行判斷[14]。但也有相反的結(jié)果，一項針對非霍奇金淋巴瘤的小樣本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)HSP90α 與淋巴瘤惡性程度、腫瘤分期、是否有B 癥狀、是否累及結(jié)外及治療反應(yīng)均無顯著相關(guān)性[15]。值得注意的是，這些針對非霍奇金淋巴瘤患者的研究中病理類型為彌漫大B細胞淋巴瘤的比例未知，以上研究結(jié)果是否能反映彌漫大B細胞淋巴瘤的情況未可知。故本研究首次針對彌漫大B細胞淋巴瘤患者外周血漿中HSP 90α的表達進行分析研究，發(fā)現(xiàn)HSP 90α水平較既往大樣本全人群對照組顯著升高[10]，這說明該指標(biāo)在彌漫大B細胞淋巴瘤中潛在的價值。

IPI 評分是反映彌漫大B細胞淋巴瘤患者疾病特征的重要參考因素，其主要包含年齡、分期、ECOG 評分、結(jié)外病變和LDH5 個方面。IPI 評分在3 分以上即為高中危、高?；颊?。在本項研究中，HSP 90α 與分期、ECOG 評分、結(jié)外病變和LDH 均顯著相關(guān)，分期晚、體力狀態(tài)差、累及2 個結(jié)外器官以上和LDH 異常的患者外周血HSP 90α水平顯著升高，這說明HSP 90α 與彌漫大B細胞淋巴瘤患者的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。然而需要關(guān)注的是，本項研究中HSP 90α 與分子分型未見關(guān)聯(lián)。而在肺癌的類似研究中發(fā)現(xiàn)血漿HSP 90α水平可預(yù)測EGFR 突變，與分子分型相關(guān)[16]。這說明雖然淋巴瘤細胞內(nèi)HSP 90 與鑒定GCB 型的關(guān)鍵因子Bcl-6 可形成復(fù)合體，但分泌至外周血漿的HSP 90α 是否與彌漫大B細胞淋巴瘤分子分型相關(guān)聯(lián)仍待商榷，需進一步擴大樣本量進行研究。

與此同時，腫瘤標(biāo)志物的一項重要作用是輔助進行腫瘤診斷。在彌漫大B細胞淋巴瘤方面，由于其通過組織病理學(xué)診斷尚需有經(jīng)驗的病理醫(yī)師才能施行，故期望通過外周血標(biāo)志物來明確該病診斷顯得較為困難。目前外周血中的LDH 升高也只能反映病情和預(yù)后。本項研究中雖發(fā)現(xiàn)HSP 90α 在彌漫大B細胞淋巴瘤中亦有顯著升高，但由于其在其他類型的多種惡性腫瘤[5-10,12,17]均有不同程度的異常增高，特別是在其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤[18,19]中也存在異常的表達。故考慮其在惡性腫瘤中表達的特異性不強，尚無特異性診斷彌漫大B細胞淋巴瘤的能力。

而在病情評估和療效監(jiān)測方面，HSP 90α 在彌漫大B細胞淋巴瘤中有著一定的臨床實踐意義。本研究發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。在治療后腫瘤負(fù)荷減小時HSP 90α 顯著下降，而在治療失敗腫瘤負(fù)荷增加時HSP 90α 又顯著升高。這是對影像學(xué)評估抗腫瘤治療療效重要且有力的補充。在前期基礎(chǔ)研究中，有報道同樣發(fā)現(xiàn)HSP 90與腫瘤細胞的增殖相關(guān)，使用HSP 90 抑制劑成為潛在抑制腫瘤生長的手段[20]。這就從基礎(chǔ)和臨床方面證實了HSP 90 與腫瘤負(fù)荷的關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

總而言之，彌漫大B細胞淋巴瘤患者血漿HSP 90α水平所在范圍為27.11 ng/ml 至300.25 ng/ml，中位數(shù)為86.57 ng/ml。這些患者血漿HSP90α的水平與Lugano 分期、IPI 評分、外周血LDH水平、ECOG 評分以及結(jié)外病變個數(shù)存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。同一患者中HSP90α 和LDH水平之間呈顯著正相關(guān)。在獲得腫瘤客觀緩解或疾病控制的患者中，評估療效時HSP 90α水平較基線顯著下降。而在一線治療失敗時，患者血漿HSP 90α水平較基線顯著升高。HSP 90α 可作為彌漫大B細胞淋巴瘤患者病情監(jiān)測及近期療效判斷的血漿腫瘤指標(biāo)。