薛瑞雪 陳峰 藺曉月 張棟 王苗利 王貴升* 周業(yè)森

（1，山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 250100；2，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 266109）

A 型流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，是一種有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒。根據(jù)血凝素（Hemagglutinin,HA）與神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性差異，目前將A 型禽流感病毒分為18 種HA 亞型和11 種NA 亞型，其中大部分亞型流感病毒來源于禽類[1]。自1994 年我國首次報道雞群中分離出H9N2亞型禽流感病毒以來[2]，該亞型流感病毒在我國廣泛存在，持續(xù)困擾養(yǎng)禽業(yè)[3,4]。

水貂是一種常見的經(jīng)濟動物，水貂養(yǎng)殖業(yè)也是山東省畜牧業(yè)的重要組成部分。近幾年國內(nèi)外關(guān)于水貂感染流感病毒的報道日益增多，2015 年，我國東部地區(qū)兩個水貂場爆發(fā)了H5N1亞型禽流感病毒，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)貂業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[5]。而H9N2亞型禽流感病毒在水貂群傳播過程中，有的毒株已獲得適應(yīng)哺乳動物突變，使其更容易感染水貂及人類[6]。因此，禽流感病毒在給水貂業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失的同時還存在潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險，所以，加強對水貂流感病毒的監(jiān)測和防控可避免造成公共衛(wèi)生安全隱患。

1 調(diào)查方法

1.1 網(wǎng)上問卷調(diào)查

網(wǎng)上設(shè)置調(diào)查內(nèi)容：養(yǎng)殖場地點、飼料種類、養(yǎng)殖環(huán)境、免疫接種等問題。將問題發(fā)送給山東省主要的水貂養(yǎng)殖戶填寫調(diào)查問卷。經(jīng)過30d 共收集不同地市養(yǎng)殖戶114 家，對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行整理、匯總，得到相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 樣品采集及檢測

1.2.1 樣品及主要試劑

2020 年8 月～12 月從威海、泰安、菏澤、濰坊水貂養(yǎng)殖場共采集181 份發(fā)病水貂肺臟器官。

Prime Script One Step RT-PCR kit Ver.2、RNA 抽提試劑TRIzol、Gel Extraction Mini Kit、pMD18-T 克隆載體、Top 10 感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker 均購自TaKaRa 公司；A型流感病毒熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒；H9亞型、H7亞型和H5亞型禽流感分型熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒購自世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1.2.2 樣品檢測

取適量各病料組織置于離心管中，加入適量的pH 7.2 的PBS 研磨成勻漿，反復(fù)凍融3 次，8000 r/min 離心5 min，取各病料上清液200 μl，按照RNA 提取試劑盒說明書從病料中提取RNA，以其為模板，采用A 型流感病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒對121 份樣品進(jìn)行檢測。

1.2.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 收錄的有關(guān)流感病毒序列，用Primer 5.0 設(shè)計流感病毒HA 和NA 擴增引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1 全基因擴增引物

1.2.4 目的基因的RT-PCR 擴增與克隆測序分析

取各病料上清液200 μl，按照TRIzol 說明書方法提取樣品總RNA。一步法RT-PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μl：2x1 Step Buffer 25 μl，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μl，引物（10 μmol/L）各2 μl，RNA 2 μl，RNase Free ddH2O 17 μl。反應(yīng)條件為：50 ℃30 min，95℃3 min，1 個循環(huán)；94 ℃30 s，53℃30 s，72 ℃1 min，32 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收產(chǎn)物克隆至pMD18-T 克隆載體由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序中心進(jìn)行測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 水貂飼料種類

養(yǎng)殖場飼喂飼料的種類有生鮮料，熟化后加工飼料和顆粒料。而生鮮料由于沒有經(jīng)過熟化，常可作為一些病毒細(xì)菌的傳染源。其中流感病毒可通過飼喂未熟制加工過的生鮮飼料感染水貂。對濰坊、日照、菏澤、威海、濱州5 個地市114 家水貂養(yǎng)殖場進(jìn)行了調(diào)查問卷，由圖1 可知，在水貂飼料中生鮮料所占比例較大，尤其是濰坊地區(qū)生鮮飼料所占比例最大，而濰坊地區(qū)不靠近海，生鮮飼料主要以禽類產(chǎn)品為主，這也為禽流感病毒在水貂中的傳播帶來了更大的可能。

圖1 不同地市生鮮料使用情況

2.2 養(yǎng)殖場養(yǎng)殖模式、周圍環(huán)境有害傳播媒介及應(yīng)對措施

經(jīng)調(diào)查，大部分水貂養(yǎng)殖屬于院舍式養(yǎng)殖模式，周圍活動的野鳥也會為流感病毒的傳播帶來可能。由圖2 可知，養(yǎng)殖場周圍有野鳥活動的養(yǎng)殖場36 家，占總養(yǎng)殖場數(shù)量的31.58%，這些養(yǎng)殖場在棚舍內(nèi)放置藥餌對鳥類進(jìn)行誘殺（占8.77%），有些養(yǎng)殖場使用專用料蓋遮擋（占5.26%），也有些噴灑專用藥物（占7.02%），這措施在一定程度上減少了鳥類對水貂健康養(yǎng)殖的影響。但仍有一部分水貂養(yǎng)殖場未采取相應(yīng)的措施（占10.53%），這將增加水貂感染的可能性。

圖2 養(yǎng)殖場周圍環(huán)境及采取措施

2.3 發(fā)病水貂處理方式

由圖3 可知，水貂發(fā)病后仍有部分養(yǎng)殖場未經(jīng)消毒直接銷售，給流感病毒的傳播帶來可能。但大部分養(yǎng)殖場都會處理，如無害化處理或消毒后再銷售，這說明大部分養(yǎng)殖戶有較強的疫病控制意識。

圖3 發(fā)病水貂處理方式

2.4 流感疫苗免疫接種

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前大多數(shù)養(yǎng)殖場的免疫只針對犬瘟熱和細(xì)小病毒，且目前沒有針對水貂流感的商品化疫苗。沒有疫苗保護增加了水貂感染流感病毒發(fā)病的可能。

2.5 臨床樣品流感病毒檢測

采用A 型流感病毒熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒對181份樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示有2 份為流感病毒陽性，這兩份病料來源于一個養(yǎng)殖場。經(jīng)H9亞型、H7亞型和H5亞型禽流感分型熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒檢測顯示均為H9亞型禽流感病毒。

2.6 HA 和NA 基因遺傳進(jìn)化分析

為進(jìn)一步分析本次鑒定毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，依據(jù)國內(nèi)外流行毒株及國內(nèi)外參考毒株核苷酸序列的同源性，使用MegAlign 軟件繪制了HA 基因（圖4）和NA 基因（圖5）的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明，該株病毒的HA 和NA 基因均屬于Y280-like 毒株，為H9N2亞型禽流感病毒。

圖4 H9N2 亞型禽流感病毒HA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 H9N2 亞型禽流感病毒NA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

經(jīng)與養(yǎng)殖場聯(lián)系發(fā)現(xiàn)，該場水貂的飼喂方式為生鮮料飼喂，且養(yǎng)殖模式為庭院式養(yǎng)殖，未采取野鳥控制措施，并未免疫流感疫苗。這有可能是該養(yǎng)殖場飼喂了發(fā)病禽的生鮮料導(dǎo)致水貂感染流感病毒。

3 討論

流感病毒為RNA 病毒，基因組很容易發(fā)生變異，由于缺乏糾錯機制，在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯誤一代代積累，使病毒發(fā)生質(zhì)的變異。目前國內(nèi)隨著水貂感染流感病例越來越多，流感在水貂中感染的情況已不容忽視。一方面，低致病性流感病毒感染后會造成幼貂存活率下降，高致病性禽流感病毒會造成高死亡率，經(jīng)濟損失嚴(yán)重[6]。另一方面，流感病毒長期對水貂感染適應(yīng)后會增強對哺乳動物的適應(yīng)性，對人類公共衛(wèi)生安全造成較大威脅。有研究發(fā)現(xiàn)，禽源H9N2亞型流感病毒在水貂群傳播過程中已獲得Q226L 的突變，使得該病毒易與哺乳動物上呼吸道唾液酸受體結(jié)合，更容易感染人類[7]。而且，H5亞型流感病毒的T160A 突變也是禽流感病毒適應(yīng)哺乳動物的突變[8]。

本次養(yǎng)殖場樣品檢測到的流感病毒HA 和NA 遺傳進(jìn)化分析顯示均屬于Y280-like 亞系，與近年其他省份禽源H9N2亞型流感病毒檢測結(jié)果一致[9-10]。提示本次水貂感染為禽源流感病毒感染所致。因此，應(yīng)加強水貂中流感病毒的監(jiān)測和防控，盡快建立水貂流感病毒的監(jiān)測機制，提高養(yǎng)殖戶的生物安全意識。