徐婧祎 安于 陳秀紅 何生虎

（寧夏大學(xué) 750021）

所謂細(xì)胞系(Cell line) 指原代細(xì)胞經(jīng)環(huán)境或認(rèn)為調(diào)控后能多次傳代的細(xì)胞群體。本實(shí)驗(yàn)雞成纖維細(xì)胞永生化后獲得的就是能穩(wěn)定傳代并沒有雜細(xì)胞的系統(tǒng)。穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建是將外源質(zhì)粒整合到目的細(xì)胞染色體上的一個(gè)過程，這一過程使得宿主細(xì)胞能長期并且穩(wěn)定的表達(dá)蛋白[1-5]。慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體[6]。與傳統(tǒng)意義的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，其對(duì)感染能力更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)通過逆轉(zhuǎn)入病毒，慢病毒感染，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株這一方式達(dá)到細(xì)胞永生化的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

電熱恒溫震蕩水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）血球計(jì)數(shù)板、24 孔板專用細(xì)胞玻片、細(xì)胞培養(yǎng)孔板（Solarbio）；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）（Gibco）；多聚甲醛（PFA）、DAPI、Triton X-100、山羊血清（Solarbio）；CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（Proteintech）、SV40 過表達(dá)慢病毒（漢尹生物）。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取10 日齡左右雞胚，用75%酒精消毒蛋殼，從氣室端用鑷子小心取出雞胚，置于培養(yǎng)皿中，用眼科剪小心除去頭、四肢和內(nèi)臟部分，剩余胚體用PBS 清洗3 次，將洗凈的胚體剪碎，并反復(fù)清洗3 次，收集剪碎的胚體，加入0.25% Trypsin 37℃水浴震蕩消化30～40min，將消化液過100μm 濾網(wǎng)，收集濾液，300g 離心5min，棄上清，重懸沉淀，鋪瓶。

1.2.2 免疫熒光鑒定

細(xì)胞玻片；固定；破膜封閉；一抗孵育，（抗體：PBS 為1:100），破膜封閉后，取50uL 一抗于防水膜上（濕盒中），蓋玻片后4℃恒溫加（最多可放置一周）二抗，室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h 后，PBS 洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS 洗3×5min/次；包埋，玻片上各滴1 滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上。

1.2.3 雞胚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

1.2.3.1 過表達(dá)慢病毒選擇

本實(shí)驗(yàn)選用的慢病毒載體元件信息為EF1α-SV40-IRES-puromycin，GFP 為熒光標(biāo)記基因，Puromycin 抗性基因標(biāo)記。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)染

將雞胚成纖維細(xì)胞接種6 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)；24h 后細(xì)胞貼壁，換液；加入1ml 完全培養(yǎng)基，再加20μL SV40 過表達(dá)慢病毒；12h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基；觀察細(xì)胞貼壁超80%，分瓶至T25 培養(yǎng)瓶中。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞擴(kuò)增3～4 代后進(jìn)行篩選。

1.2.4 雞胚成纖維細(xì)胞的篩選

1.2.4.1 殺滅曲線

未處理的雞胚成纖維細(xì)胞按每孔0.05million 鋪入24 孔板，孵育過夜；第2 天，棄掉廢液；將含不同濃度嘌呤霉素（1、2、3、4、5、6、7ug/ml）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板；每2d 換篩選培養(yǎng)基一次；每天觀察細(xì)胞的變化；最小的嘌呤霉素使用濃度是從嘌呤霉素篩選開始1～4d 內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最低篩選濃度。

1.2.4.2 嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞

首日，將轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細(xì)胞按每孔0.05million 加至24孔板，孵育過夜；24h 后除去板中廢液；加入含嘌呤霉素（1ug/ml）的篩選培養(yǎng)基，孵育，對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 雞胚成纖維細(xì)胞的擴(kuò)增

倒出廢液，加入無菌pbs 洗液（5～8ml）輕輕潤濕細(xì)胞，之后吸走洗液；向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA 的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限；置溫箱中2～5min，終止消化；加入該細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基6ml 終止消化，形成細(xì)胞懸液。依據(jù)傳代比例，將細(xì)胞懸液分瓶，再補(bǔ)充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng)，直至貼壁。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞收集

原代細(xì)胞分離后，細(xì)胞分布均勻但仍有少量雜細(xì)胞分布，細(xì)胞活性良好。

2.2 免疫熒光鑒定

通過DAPI 染色，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，熒光顯微鏡下觀察有藍(lán)色熒光，用Fluoromount-G 封片劑后封片，可以清晰看到細(xì)胞分布均勻且間距勻稱，熒光反應(yīng)明顯，見圖1。

圖1 DAPI 染色及封片熒光圖

2.3 轉(zhuǎn)染結(jié)果

用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染雞胚胎成纖維細(xì)胞，24h 后實(shí)驗(yàn)細(xì)胞被接種在滅活飼養(yǎng)層，在轉(zhuǎn)染5d 后出現(xiàn)明顯的菌落細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的干細(xì)胞大核和核仁顯著等特點(diǎn)。穩(wěn)定重編程細(xì)胞培養(yǎng)在無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，獲得的細(xì)胞在人工基膜上傳代超過50代次，表明這些細(xì)胞獲得永生性特征，見圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞顯微鏡結(jié)構(gòu)

2.4 殺滅濃度及嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞

通過未轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細(xì)胞與不同濃度嘌呤霉素（1、2、3、4、5、6、7ug/ml）作用后，可見嘌呤霉素篩選開始1～4d 內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最低篩選濃度，確定使用濃度為1ug/ml，作用時(shí)間為2d。

將上一步得到的結(jié)果用于已轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細(xì)胞，作用2d 后通過顯微鏡可見白色亮點(diǎn)為已死細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功后的雞胚成纖維細(xì)胞。

2.5 雞胚成纖維細(xì)胞永生化后擴(kuò)增

將上一步得到的已轉(zhuǎn)染的雞胚成纖維細(xì)胞通過胰酶消化法進(jìn)一步擴(kuò)增，擴(kuò)增到12 代時(shí)，通過顯微鏡觀察得到如下圖片所示結(jié)果，可見細(xì)胞數(shù)量多，分布均勻，體態(tài)完整，形態(tài)正常，為紡錘形或星型，貼壁，見圖3。

圖3 初代永生化細(xì)胞

3 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于雞胚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法比較常見，傳代穩(wěn)定的雞胚成纖維細(xì)胞系常用的是商品株DF-1，但雞胚成纖維細(xì)胞通過永生化而轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定傳代細(xì)胞系的報(bào)道比較少見。

本實(shí)驗(yàn)中通過慢病毒感染進(jìn)一步獲得需要細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的過程包括病毒與目的細(xì)胞吸附、病毒變形內(nèi)化、入胞、細(xì)胞內(nèi)再定位、病毒脫衣殼、入核、復(fù)制及包裝[7]，本實(shí)驗(yàn)中用于細(xì)胞改造的慢病毒毒性基因已被剔除屬于假型病毒[8]，感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，并且不會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，具有低毒性，在實(shí)驗(yàn)過程中也不會(huì)發(fā)生特異性反應(yīng)[9-11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過一系列驗(yàn)證，目的細(xì)胞永生化，通過這一試驗(yàn)為以后其他種類的纖維細(xì)胞永生化提供一定的基礎(chǔ)。