談冬錦，石敏，徐玉迪，張紅，

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)淮安臨床學(xué)院，江蘇 淮安 223300； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 淮安 223300)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，30%～40%的1型糖尿病和2型糖尿病患者可發(fā)展為DKD，其中約一半的患者將進(jìn)展為終末期腎臟病，已成為糖尿病患者死亡的主要原因，對(duì)社會(huì)發(fā)展和人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅[1]。目前在治療DKD方面，雖然已經(jīng)證實(shí)新近研發(fā)的鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑和胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑可以延緩腎臟疾病的進(jìn)展及減少心血管事件的發(fā)生[2-3]，但并沒(méi)有從根源上遏制DKD的產(chǎn)生，需要更深入地了解DKD潛在的遺傳因素和分子機(jī)制，從而確定更好的診斷和治療方法。隨著基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了大量的高通量基因分析結(jié)果，從而誕生了眾多的公共數(shù)據(jù)庫(kù)，為研究疾病生物學(xué)過(guò)程和潛在的發(fā)病機(jī)制提供了便利。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析DKD中腎小球相關(guān)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，通過(guò)富集分析評(píng)估其生物學(xué)功能，并建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)和微RNA(microRNA，miRNA)-DEGs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等尋找關(guān)鍵基因和miRNA，以期為DKD的診斷和治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)的獲取 本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心-GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“diabetic kidney disease”和“diabetic nephropathy”為關(guān)鍵詞，研究類(lèi)型為“Expression profiling by array”，物種為“Homo sapiens”，經(jīng)過(guò)仔細(xì)篩選共獲得36個(gè)數(shù)據(jù)集，選擇GSE30528和GSE1009兩個(gè)與腎小球有關(guān)的DKD數(shù)據(jù)集進(jìn)行下一步分析，試驗(yàn)平臺(tái)分別為GPL571和GPL8300。其中，GSE30528含有來(lái)自DKD患者的9個(gè)腎小球組織樣本和13個(gè)對(duì)照腎小球組織樣本。GSE1009含有3個(gè)DKD和3個(gè)對(duì)照人腎小球組織樣本。

1.2DEGs的識(shí)別 利用GEO2R在線(xiàn)工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/geo2r)對(duì)微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別篩選兩個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs，在下載DEGs數(shù)據(jù)后，進(jìn)一步篩選，標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|>1且調(diào)整后的P<0.05，并通過(guò)在線(xiàn)工具繪制韋恩圖(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)獲得在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中重疊的DEGs。

1.3生物功能和信號(hào)通路富集分析 將重疊的DEGs導(dǎo)入Metascape在線(xiàn)工具(https://metascape.org/)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encycopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，篩選條件P<0.01，并利用R語(yǔ)言裝載GOplot包使結(jié)果可視化，分析重疊DEGs的生物功能和參與的信號(hào)通路。GO富集分析包括生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分。KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，深入分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑和功能，有助于將基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)的建立 將重疊DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)分析對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，界值設(shè)定為0.4，結(jié)果應(yīng)用Cytoscape軟件可視化，利用CytoHubba插件選擇最大集團(tuán)中心性算法計(jì)算得到前5個(gè)基因即為Hub基因，從而分析網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白質(zhì)。

1.5miRNA-DEGs網(wǎng)絡(luò)的建立 將重疊DEGs導(dǎo)入NetworkAnalyst在線(xiàn)工具(https://www.networkanalyst.ca/)，建立miRNA-DEGs交互網(wǎng)絡(luò)，數(shù)據(jù)庫(kù)采用miRTarBase v8.0，獲得的miRNA進(jìn)一步篩選，標(biāo)準(zhǔn)為自由度>2，應(yīng)用Cytoscape軟件 (https://www.cytoscape.org/)使結(jié)果可視化，從而分析重疊DEGs上游miRNA的調(diào)控情況。

2 結(jié) 果

2.1重疊DEGs的篩選 通過(guò)GEO2R在線(xiàn)工具分析兩個(gè)數(shù)據(jù)集并形成火山圖(圖1)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選，在GSE30528中確定了632個(gè)DEGs，在GSE1009中確定了49個(gè)DEGs，兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的交集包含26個(gè)DEGs(圖2)，均在DKD中表達(dá)上調(diào)，包括二氫嘧啶酶樣蛋白3、1號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框21、信號(hào)素5A、磷脂酶Cε1、ST3β-半乳糖苷α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶6、1型血小板反應(yīng)蛋白7A域、巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ浮⒛蜃英蚰甘荏w、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅴ、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、生長(zhǎng)抑制特異性蛋白1、同種異體移植炎癥因子1、微管結(jié)合蛋白、細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白5、叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1)、IQ模體的GTP酶活化蛋白2、磷脂酶A2受體1、同源框基因1、凝血因子Ⅲ、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1、酪氨酸激酶3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體(protein tyrosine phosphatase receptor，PTPR)O、GDP甘露糖-4，6-脫水酶、肌鈣蛋白C1、PTPRD。

2.2GO和KEGG富集分析 采用Metascape在線(xiàn)工具進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并利用R語(yǔ)言裝載GOplot包使結(jié)果可視化，其中GO富集分析結(jié)果見(jiàn)圖3，展示了每個(gè)層面上P值最小的5個(gè)富集項(xiàng)目，在生物過(guò)程上，重疊DEGs主要富集在腎臟和泌尿系統(tǒng)的形成以及正向調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移等方面；在細(xì)胞成分上，主要富集在板狀偽足、細(xì)胞前緣、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等方面；在分子功能上，主要富集在磷酸酯水解酶活性、蛋白質(zhì)同型二聚化活性、糖胺聚糖結(jié)合等方面。KEGG富集分析結(jié)果見(jiàn)圖4，重疊DEGs主要參與7條信號(hào)通路，包括糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號(hào)通路和癌癥相關(guān)信號(hào)通路。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)圖 重疊DEGs形成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖5，包括1個(gè)主網(wǎng)絡(luò)和2個(gè)次網(wǎng)絡(luò)，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖由17個(gè)節(jié)點(diǎn)和16條邊形成，其中VEGFA位于核心位置，與8種蛋白有關(guān)，如FOXCO1、BMP2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1等。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，應(yīng)用MCC算法得到排名前5的Hub基因?yàn)閂EGFA、信號(hào)素5A、1型血小板反應(yīng)蛋白7A域、磷脂酶A2受體1、FOXC1。

DEGs：差異表達(dá)基因；CON：正常對(duì)照組；DKD：糖尿病腎臟疾病組；fold change：差異倍數(shù)；1a：GSE30528；1b：GSE1009；藍(lán)色：下調(diào)的DEGs；紅色：上調(diào)的DEGs；黑色：無(wú)差異的基因

圖2 兩個(gè)數(shù)據(jù)集重疊的差異表達(dá)基因

2.4構(gòu)建miRNA-DEGs網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)NetworkAnalyst建立miRNA-DEGs網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖6，共獲得693個(gè)節(jié)點(diǎn)，901條邊。其中具有最多交互miRNAs的前3個(gè)基因?yàn)閂EGFA、FOXC1、酪氨酸激酶3，邊線(xiàn)分別為126、106、99。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選后得到36個(gè)miRNAs，其中hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p屬于miR-17家族，共同靶向最多的6個(gè)DEGs，分別為VEGFA、BMP2、FOXC1、凝血因子Ⅱ凝血酶受體、凝血因子Ⅲ、PTPRO，靶向5個(gè)DEGs的miRNAs分別為hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-106b-5和hsa-miR-355-5p。

DEGs：差異表達(dá)基因；GO：基因本體論；BP：生物過(guò)程；CC：細(xì)胞成分；MF：分子功能

DEGs：差異表達(dá)基因；KEGG：京都基因與基因組百科全書(shū)；rich factor：富集到的基因數(shù)與該條通路基因總數(shù)之比；count：富集到該通路的基因數(shù)

DEGs：差異表達(dá)基因；PPI：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

miRNA：微RNA；DEGs：差異表達(dá)基因；粉紅色圓形的為重疊DEGs，黃色六邊形的為miRNA，中央兩個(gè)黃色六邊形是靶向6個(gè)重疊DEGs的miRNA

3 討 論

DKD是糖尿病常見(jiàn)的一種微血管并發(fā)癥，腎臟代謝環(huán)境的改變以及血流動(dòng)力學(xué)的異常引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞去分化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路異常等病理生理學(xué)活動(dòng)[4-5]，出現(xiàn)腎小球基膜增厚、足細(xì)胞損傷、系膜基質(zhì)擴(kuò)張、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化等病理改變，進(jìn)而損傷腎小球?yàn)V過(guò)膜、破壞腎小管功能，最終出現(xiàn)白蛋白尿和腎功能下降[6-8]。雖然鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑和胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑能夠改善DKD，但仍無(wú)法根治。隨著基因組學(xué)和生物信息技術(shù)的發(fā)展，遺傳學(xué)研究表明DKD的發(fā)病與基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變有關(guān)，這為從根本上解決DKD提供了方向[9]。

本研究通過(guò)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載DKD相關(guān)的腎小球基因芯片數(shù)據(jù)集，采用生物信息學(xué)技術(shù)識(shí)別出2個(gè)數(shù)據(jù)集重疊的26個(gè)DGEs，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，DEGs主要與腎臟和泌尿系統(tǒng)的形成、板狀偽足、細(xì)胞前緣、磷酸酯水解酶活性、蛋白質(zhì)同型二聚化活性等功能和細(xì)胞成分有關(guān)，參與的信號(hào)通路包括AGE-RAGE信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。其中，AGE-RAGE信號(hào)通路能夠觸發(fā)多種途徑，增加炎癥細(xì)胞因子的釋放，產(chǎn)生活性氧類(lèi)，并激活核因子κB等加重DKD的進(jìn)展[5,10]。而Rap1信號(hào)通路可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子1α信號(hào)改善鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠線(xiàn)粒體功能障礙，從而減輕腎小管損傷[11]。PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬機(jī)制在DKD中受到抑制，降低了機(jī)體對(duì)高糖引起血管內(nèi)皮功能障礙和足細(xì)胞損傷的敏感性，從而進(jìn)一步加重腎損傷[12]。這表明篩選出的DEGs可以通過(guò)炎癥、氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能障礙、自噬等途徑影響DKD的進(jìn)展，但需進(jìn)一步探究。

為了分析重疊的DEGs上游miRNA，本研究建立了miRNA-DEGs網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p共同靶向最多的6個(gè)DEGs，而這兩個(gè)miRNAs同屬于miR-17家族，由6個(gè)序列相似、結(jié)構(gòu)相仿、種子區(qū)序列相同(AAAGUGCU)、物種間高度保守的成熟體miRNA組成。有研究表明，DKD患者腎組織miR-17-5p和miR-20a-5p表達(dá)水平升高，體外實(shí)驗(yàn)中在高糖培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞中下調(diào) miR-17-5p和miR-20a-5p能夠有效抑制足細(xì)胞功能障礙、凋亡和纖維化[13-14]。Tian等[15]的研究表明，miR-20a-5p與circ-ADAM9上調(diào)的人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和自噬相關(guān)蛋白7相互作用，從而抑制Akt和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的磷酸化，加劇高糖條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬和凋亡，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。在C57BL6J小鼠的糖尿病視網(wǎng)膜病變中，miR-20a-5p等8種miRNAs被檢測(cè)到表達(dá)異常，而VEGFA、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α等被驗(yàn)證為失調(diào)miRNA的靶標(biāo)，繼而調(diào)節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜的蛋白異常表達(dá)[16]。

在本研究PPI網(wǎng)絡(luò)和CytoHubba插件計(jì)算得到的Hub基因中，VEGFA占據(jù)網(wǎng)絡(luò)核心位置。VEGFA是足細(xì)胞高表達(dá)的血小板源性生長(zhǎng)因子超家族的一種分泌型糖蛋白，其基因產(chǎn)物為同型二聚體，具有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分化和存活密切相關(guān)[17-19]。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞利用蛋白多糖、糖胺聚糖、糖蛋白和可溶性血漿蛋白組成的內(nèi)皮糖萼可以限制蛋白質(zhì)通過(guò)高度特異化的腎小球毛細(xì)血管壁，而VEGFA為腎小球內(nèi)皮細(xì)胞提供必要的支持功能，如再生、維持“開(kāi)窗”信號(hào)和調(diào)節(jié)蛋白通道信號(hào)等，因此VEGFA水平過(guò)度升高被認(rèn)為是DKD白蛋白尿產(chǎn)生的原因之一[20-22]，而阻斷其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2可改善2型糖尿病DKD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷哪I損害[23]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，治療腎臟病的中藥制劑雷公藤和黃芪可能通過(guò)下調(diào)VEGFA，減輕腎臟炎癥，降低尿白蛋白水平[24-25]。因此推測(cè)DKD中miR-17家族過(guò)表達(dá)可引起足細(xì)胞損傷導(dǎo)致VEGFA分泌過(guò)度減少，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，“開(kāi)窗”信號(hào)不能維持，致使尿白蛋白水平升高不明顯，這可能是部分DKD患者腎小球?yàn)V過(guò)率已出現(xiàn)降低而尿白蛋白排泄未相應(yīng)增加的原因。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)獲得DEGs，分析其生物學(xué)功能和富集的信號(hào)通路，并借助在線(xiàn)工具尋找到核心基因VEGFA，與Geng等[26]的結(jié)果類(lèi)似，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立了miRNA-DEGs網(wǎng)絡(luò)，探討核心基因及其上游miRNA在DKD中所起的作用，為研究DKD的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療提供了新見(jiàn)解。然而，本研究樣本量少且缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，下一步將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，以進(jìn)一步闡明miR-17家族與VEGFA在DKD中的聯(lián)系和作用機(jī)制。