朱依晗， 劉寧芳， 胡龍興， 徐 倩

(湖南農業(yè)大學農學院草業(yè)科學系， 湖南 長沙 410128)

我國鹽堿地面積約有9 913萬hm2，是我國重要的后備土地資源，改良和充分利用鹽堿土對糧食生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義[1]。篩選和培育耐鹽植物品種，是土壤鹽堿化改良和利用的主要途徑[2]，而對植物進行耐鹽堿性評價，是植物耐鹽堿育種和種質資源創(chuàng)新的基礎[3]。

鹽堿脅迫作為限制植物生長的重要環(huán)境因素，對植物從種子萌發(fā)到開花結實整個生長發(fā)育過程均有諸多影響，會造成植物發(fā)芽勢和發(fā)芽率低、發(fā)芽延遲、幼苗死亡率高、葉綠素含量減少和光合性能降低等影響[4-5]。種子萌發(fā)期和胚根胚芽伸長期是對鹽堿脅迫反應最為敏感的時期，因此采用種子萌發(fā)試驗進行種質資源的耐鹽堿性篩選與評價是植物抗逆性研究中一種常用的方法[6]。鹽堿脅迫包括中性鹽和堿性鹽脅迫兩大類，目前關于中性鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響研究較多[7-8]，而堿性鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響研究相對較少，本研究采用NaHCO3溶液模擬堿性鹽脅迫，探究鹽堿脅迫對綠穗莧(Amaranthushybriaus)種子萌發(fā)的影響以及不同基因型綠穗莧種質資源之間耐鹽堿性的差異，從而為耐鹽堿綠穗莧品種的選育和種植提供理論基礎。

綠穗莧為莧科莧屬一年生糧食、飼料、蔬菜、綠肥、醫(yī)藥等多種用途的新型農作物。綠穗莧根系發(fā)達，主根入土深度達2.45 m以上，側根數(shù)量多，利用土壤中的水分、養(yǎng)分的能力強，對干旱、瘠薄、鹽堿等逆境脅迫具有較強的耐受性，可用于改良各種不良土壤，也可用于防治水土流失、治理土地沙化[4,9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，不同的莧屬植物種質資源對鹽脅迫的響應不同。因此，本試驗選取8份不同來源的綠穗莧種質資源進行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，以期篩選出耐鹽堿種質，為綠穗莧的耐鹽機理和后期的耐鹽堿綠穗莧新品種選育與應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試的8份綠穗莧種質資源均來自美國農業(yè)部種質資源庫(表1)。NaHCO3溶液濃度篩選試驗選用的植物材料為本地籽粒莧種質資源‘1378’，保存在本課題組種質資源圃。

表1 8份綠穗莧種質資源信息Table 1 Basic information for the 8 A. hybridus germplasm resources

1.2 試驗設計與處理

為了篩選合適的鹽處理濃度，首先選用本地籽粒莧種質資源‘1378’進行種子萌發(fā)試驗。試驗采用玻璃培養(yǎng)皿(9 cm)進行，每皿中鋪入兩張大小相同的濾紙，分別加入2 mL濃度為0 mmol·L-1(CK，pH=6.80)，40 mmol·L-1(pH=8.54)，80 mmol·L-1(pH=8.42)，120 mmol·L-1(pH=8.31)，160 mmol·L-1(pH=8.26)，200 mmol· L-1(pH=8.17)的NaHCO3溶液，選取完整、飽滿且無病蟲害的種子，用5%的NaClO溶液消毒5 min，再用蒸餾水反復沖洗后均勻播撒在濾紙上，每皿30粒，置于25℃/20℃(光照/黑暗，14 h/10 h)的人工氣候室中培養(yǎng)，各處理均重復4次。

根據(jù)不同NaHCO3濃度下‘1378’的種子萌發(fā)情況，確定合適的鹽堿脅迫處理濃度，對8份不同來源的綠穗莧種質資源進行耐鹽堿性篩選與評價，處理方式同上。

1.3 測定指標與方法

種子萌發(fā)過程中，每天同一時間采用稱重法進行補水，每隔24 h記錄一次種子發(fā)芽情況。于第4天計算種子發(fā)芽勢，待所有種子萌發(fā)結束時計算種子發(fā)芽率，萌發(fā)結束的標準為種子3天內不再有新的發(fā)芽數(shù)[11]。種子萌發(fā)結束后從每個處理中隨機選取10株苗，用精度為0.01 cm的游標卡尺對幼苗的根長和芽長進行測量。測定指標參考前人文獻[12-14]，具體計算方法如下：

發(fā)芽指數(shù)=Σ(Gt/Dt)

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×根長

其中，Gt為第t天種子的發(fā)芽量，Dt為相應的發(fā)芽試驗天數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗所有數(shù)據(jù)采用Excel 2020進行整理，并運用SPSS 19.0 和DPS 9.01分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。參試材料采用模糊數(shù)學中的隸屬函數(shù)法計算材料的綜合隸屬函數(shù)值，并對所有材料的綜合耐鹽性進行評價。為減少材料中單一指標的差異性過大而影響結論，計算采用了多個指標的相對值進行分析，包括相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)。

模糊隸屬函數(shù)的計算公式：F=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中F表示某一項評價指標的隸屬函數(shù)值，X表示某一項評價指標的測定值，Xmin，Xmax為所有參試材料某一指標的最小值和最大值；如果某一指標與抗性指標呈負相關，可通過反隸屬函數(shù)計算，計算公式為：F= 1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。隸屬函數(shù)平均值越大表明該品種的耐鹽性越強[15]。每份材料先通過模糊數(shù)學中隸屬函數(shù)的公式計算出各指標的隸屬值，然后再把同一品種的不同指標的隸屬函數(shù)值累加求平均值，最后把平均值用DPS軟件進行系統(tǒng)聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同鹽堿濃度對綠穗莧種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

由表2可知，與對照組相比，鹽堿脅迫對綠穗莧的種子萌發(fā)有抑制作用，且隨著NaHCO3濃度的升高，抑制作用逐漸增強，但不同指標對鹽堿脅迫的響應不同：當NaHCO3濃度達到40 mmol· L-1時，與對照組相比，幼苗的根長顯著縮短，但發(fā)芽勢、發(fā)芽率和芽長并沒有顯著的變化；當NaHCO3濃度達到80 mmol· L-1時，綠穗莧的發(fā)芽勢也開始顯著降低(P<0.05)，但發(fā)芽率和芽長兩個指標只有在NaHCO3濃度達到120 mmol· L-1后才開始顯著降低(P<0.05)。綜合考慮以上結果，后續(xù)試驗采用100 mmol· L-1(pH 8.35)作為NaHCO3脅迫的處理濃度，用于篩選和評價不同綠穗莧種質資源的耐鹽堿性。

表2 不同濃度NaHCO3溶液對綠穗莧各項觀測指標的影響Table 2 Effects of different NaHCO3 solution on various indexes of A. hybridus

2.2 鹽堿脅迫對不同基因型綠穗莧種子萌發(fā)的影響

種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率是衡量植物耐鹽性的重要指標之一[16]。由表3可知，在正常條件下，不同基因型綠穗莧種子間的發(fā)芽率除Ahb2外其它基因型間均無顯著差異，但發(fā)芽勢存在顯著差異，其中Ahb2和Ahb986顯著低于除Ahb1和Ahb1025外的其它基因型(P<0.05)。與對照組相比，除Ahb1外，鹽堿脅迫條件下綠穗莧種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均出現(xiàn)不同程度的下降，不同基因型的種子對鹽堿脅迫的響應存在顯著差異。其中，基因型Ahb1，Ahb911和Ahb979對鹽堿脅迫最不敏感，100 mmol·L-1NaHCO3處理條件下發(fā)芽率均高于90%，且與對照組相比無顯著差異；而基因型Ahb2，Ahb984，Ahb986，Ahb1011和Ahb1025的發(fā)芽率與對照相比顯著下降(P<0.05)，分別降低了34.88%，13.79%，53.85%，53.57%和52.83%。

表3 100 mmol·L-1 NaHCO3對8份不同基因型綠穗莧種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Table 3 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on germination potential and germination rate of 8 A. hybridus seeds

鹽堿脅迫條件下，基因型Ahb1，Ahb911，Ahb979和Ahb984的相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率均高于80%，其余基因型均較低，其中Ahb1011的相對發(fā)芽勢僅為23.64%(圖1)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，8份材料中，大部分材料的相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率數(shù)值相近，只有Ahb1011的差異較大，分別為23.64%和46.43%，說明鹽堿脅迫在Ahb1011種子萌發(fā)早期的抑制作用較為明顯。

圖1 100 mmol·L-1 NaHCO3對8份綠穗莧種子相對發(fā)芽勢(a)和相對發(fā)芽率(b)的影響Fig.1 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on relative germination potential (a) and relative germination rate (b) of 8 A. hybridus seeds注：不同小寫字母表示不同基因型材料間差異顯著(P<0.05)。下同Note：Different lowercase letters indicate significant difference among A. hybridus resources at the 0.05 level. The same as below

2.3 鹽堿脅迫對不同基因型綠穗莧幼苗生長的影響

由表4可知，正常培養(yǎng)條件下，本試驗8份綠穗莧材料的根長之間存在一定的差異，其中基因型Ahb2的根長最短，僅12.64 mm，Ahb979的根長最長，為40.81 mm。不過正常培養(yǎng)條件下，除Ahb2外，其它基因型的芽長之間均無顯著差異。

表4 100 mmol·L-1 NaHCO3對8份不同基因型綠穗莧根長和芽長的影響Table 4 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on root length and bud length of 8 A. hybridus

在鹽堿脅迫處理下，除Ahb984外，其他試驗材料的根和芽的生長均受到了顯著抑制。其中，Ahb2和Ahb1025兩份材料的根系受到鹽堿脅迫的抑制作用最小，相對根長分別為19.76%和15.97%；Ahb911和Ahb979的根系受到鹽堿脅迫的抑制作用最大，相對根長分別為9.59%和8.14%(圖2a)。不同材料的芽長對鹽堿脅迫的響應也存在很大差異，其中，Ahb1受到的抑制作用最為明顯，相對芽長僅為32.87%，而其他基因型的相對芽長則都在40%以上?？傮w來看，堿性鹽脅迫條件下，大部分綠穗莧材料的根系受抑制程度比芽受抑制的程度更強，不同材料的相對根長大多在20%以下，而相對芽長則在30%到50%之間(圖2b)。通過計算根芽比可知，大部分材料的根芽比受到了鹽堿脅迫的顯著抑制，只有Ahb2和Ahb1025兩份材料與對照組的差異不顯著。

圖2 100 mmol·L-1 NaHCO3對8份綠穗莧相對根長(2a)和相對芽長(2b)的影響Fig.2 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on relative root length (2a) and relative bud length (2b) of 8 A. hybridus

2.4 鹽堿脅迫對不同基因型綠穗莧發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

由表5可知，8份不同基因型綠穗莧的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在堿性鹽脅迫處理下均有所下降，且不同基因型的下降幅度差異很大：基因型Ahb986，Ahb1011和Ahb1025的發(fā)芽指數(shù)下降幅度較大，分別高達67.16%，77.21%和69.76%，Ahb1下降幅度最小，僅10.53%；活力指數(shù)除了基因型Ahb2只下降了89.81%以外，其他材料的活力指數(shù)均下降90%以上，說明100 mmol·L-1NaHCO3鹽溶液對受試種子的活力影響較大。

表5 100 mmol·L-1 NaHCO3對8份不同基因型綠穗莧種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 5 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3 on germination index and vigor index of 8 A. hybridus seeds

進一步分析顯示(圖3)，相對發(fā)芽指數(shù)較低的基因型，其種子的相對活力指數(shù)也較低，比如Ahb986，Ahb1011和Ahb1025，相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)在受試材料中均較低。

圖3 100 mmol·L-1 NaHCO3對8份綠穗莧種子相對發(fā)芽指數(shù)(3a)和相對活力指數(shù)(3b)的影響Fig.3 Effects of 100 mmol·L-1 NaHCO3on relative germination index (3a) and relative vigor index (3b) of 8 A. hybridus seeds

2.5 不同基因型綠穗莧種子萌發(fā)期耐鹽堿性綜合評價

為了全面綜合反映8份綠穗莧材料的耐鹽堿能力，本研究采用相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對芽長、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)這6項指標，根據(jù)模糊隸屬函數(shù)公式計算出每一指標對應的隸屬函數(shù)值，然后通過所有指標的函數(shù)值求出每個基因型的隸屬函數(shù)值，并以此為標準對參試的綠穗莧材料萌發(fā)期的綜合耐鹽能力進行評價及排序。結果如表6所示，參試的8份綠穗莧材料的隸屬函數(shù)平均值在0.182～0.707之間，綜合耐鹽性排序由強至弱依次為：Ahb1 > Ahb911 > Ahb2 > Ahb984 > Ahb979 > Ahb1025 > Ahb986 > Ahb1011。通過系統(tǒng)聚類分析，將以上8份綠穗莧材料大致分為三類：耐鹽堿性較好的種質有Ahb1,Ahb911,Ahb2,Ahb984和Ahb979五個基因型，耐鹽堿性中等的只有Ahb1025，對鹽堿脅迫耐性較差的有基因型Ahb986和Ahb1011(圖4)。

表6 綠穗莧萌發(fā)期耐鹽性隸屬函數(shù)及排序Table 6 Membership functions and sorting of A. hybridus during germination

圖4 8份綠穗莧種質資源耐鹽性聚類Fig.4 Dendrogram of salt tolerance for the 8 A. hybridus germplasm resources

3 討論

鹽堿脅迫條件下植物種子萌發(fā)情況在一定程度上體現(xiàn)了植物的耐鹽性，因此發(fā)芽勢和發(fā)芽率是衡量植物耐鹽性的重要指標[6]。本研究首先采用不同濃度NaHCO3溶液對綠穗莧種子進行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)NaHCO3濃度高于40 mmol· L-1時綠穗莧的各項生長指標均受到一定程度的抑制，且隨著NaHCO3溶液濃度的升高，抑制作用逐漸增強，這與前人的研究相符[17-19]。同時，一些研究發(fā)現(xiàn)，植物不同的生長指標對鹽脅迫的響應不同，比如100 mmol· L-1的鹽脅迫雖然會抑制石竹(Dianthuschinensis)種子的萌發(fā)，但對植株幼苗的莖粗卻有顯著的促進作用[20]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，植株的根長在NaHCO3溶液濃度達到40 mmol· L-1時就顯著縮短，而NaHCO3溶液濃度為80 mmol· L-1時，綠穗莧的發(fā)芽勢才受到顯著的抑制，但該濃度條件下植株的發(fā)芽率和芽長均未受到明顯影響，直至NaHCO3溶液濃度達到120 mmol· L-1時，發(fā)芽率和芽長才開始受到顯著抑制。因此，本試驗采用100 mmol· L-1NaHCO3溶液開展后續(xù)不同來源綠穗莧種子耐鹽堿性評價。

很多研究均表明，不同植物以及同一種植物的不同品種對鹽脅迫的耐性不同[21]。馮鐘慧等對6個不同品種的莧屬植物種子進行萌發(fā)期耐鹽性鑒定，結果表明不同材料的種子萌發(fā)期耐鹽性表現(xiàn)差異顯著[22]。植物作為一個復雜的生命體，其對鹽堿脅迫的響應涉及到多種生理生化反應，包括離子穩(wěn)態(tài)、滲透調節(jié)劑的合成、活性氧的清除和內源激素的代謝等[23-24]。同時，植物的很多生長發(fā)育過程都會受到鹽堿脅迫的影響，只使用單項指標難以全面準確地反映植物品種的耐鹽堿能力[25-26]。因此，本研究在總結前人分析方法的基礎上，采用系統(tǒng)聚類分析及模糊隸屬函數(shù)等分析方法，選取鹽堿脅迫條件下6項生長指標的變化來評價綠穗莧種質資源的耐鹽堿性強弱，避免了只分析單一指標的片面性，使分析結果更加可靠[27]。

根據(jù)種子萌發(fā)相關指標可以對不同品種的耐鹽性進行分類，比如，宋家興等人根據(jù)相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對根長和相對芽長5個指標將37份無芒雀麥(Bromusinermis)進行聚類分析，劃分為耐鹽、敏鹽、中度耐鹽3種類型[28]。本研究中亦采用相似方法，根據(jù)鹽堿脅迫下不同基因型的8份綠穗莧材料的各項指標進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)大部分品種(80%左右)比較耐鹽。本研究還發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫對植物根生長的抑制作用比對芽更加顯著，這也與徐曼等[29]和郭慧娟等人[30]的研究結果相符合。

4 結論

本研究通過對8份綠穗莧種子萌發(fā)期主要的生長指標進行分析，發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫處理對綠穗莧的生長發(fā)育具有一定的抑制作用，且參試的8份材料其各項指標對鹽堿脅迫的響應不同，通過隸屬函數(shù)法分析，對受試8份綠穗莧種質資源萌發(fā)期耐鹽性強弱進行排序，結果為：Ahb1>Ahb911>Ahb2>Ahb984>Ahb979>Ahb1025>Ahb986>Ahb1011。通過聚類分析可以將受試種質資源分為三大類，其中對鹽堿脅迫耐性較好的有Ahb1，Ahb2，Ahb984，Ahb911和Ahb979五個基因型，耐鹽堿性中等的只有Ahb1025，Ahb986和Ahb1011耐鹽堿性較差。