高 歌 查 旭 劉偉進(jìn) 楊 慧

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物系 北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所 北京市神經(jīng)再生修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，臨床上常表現(xiàn)為肌僵直，運(yùn)動(dòng)遲緩，靜止性震顫，姿勢(shì)步態(tài)異常等。PD的典型病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易氏體 (Lewy bodies，LBs) 。LBs的主要成分是α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)，其中90%的為129位絲氨酸磷酸化的α-syn(phosphorylated α-syn monomer,p-α-syn)。研究[1]顯示，PD患者血漿和腦脊液中129位絲氨酸磷酸化的α-syn與對(duì)照組相比顯著增加， p-α-syn可以作為PD診斷的潛在生物標(biāo)志物，并且也可以作為PD進(jìn)程的指標(biāo)之一[2]。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前分析α-syn在血漿和腦脊液中的主要方法[3]，但是，由于其在血漿中含量低，檢測(cè)方法不統(tǒng)一，使α-syn的檢測(cè)出現(xiàn)不一致甚至是矛盾的結(jié)果[4-5]，迫切需要更穩(wěn)定和靈敏的檢測(cè)方法。解離-增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析(dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay, DELFIA)于1983年被首次報(bào)道[6]，DELFIA通常使用銪(Eu3+)螯合物標(biāo)記的抗體作為分子探針，能通過(guò)時(shí)間分辨熒光降低非特異性信號(hào)，在檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)線性范圍和檢測(cè)穩(wěn)定性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，目前未見(jiàn)到其應(yīng)用到檢測(cè)血漿p-α-syn中。因此，本研究構(gòu)建了DELIFA檢測(cè)p-α-syn的雙抗夾心法檢測(cè)體系，其中包括制備和驗(yàn)證各種標(biāo)準(zhǔn)抗原，驗(yàn)證捕獲抗體及檢測(cè)抗體等，探究本實(shí)驗(yàn)室制備的抗體對(duì)在DELFIA方法中對(duì)p-α-syn是否有更高的特異度和靈敏度，并在Thy1-α-SYN轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿中進(jìn)行了初步應(yīng)用，以期為PD的診斷提供一種更靈敏可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Thy1-α-SYN轉(zhuǎn)基因小鼠(品系：C57BL/6N，Line 15，購(gòu)于Jackson laboratory公司，美國(guó))，雄性，月齡：6月和12月。小鼠分為2組：轉(zhuǎn)基因小鼠組(Tg)及同窩野生小鼠對(duì)照組(Wt)。

1.2 抗體及試劑

C140S：129位絲氨酸磷酸化α-syn抗體，鼠源單隆抗體，免疫肽段第123～132位氨基酸Ac-CEAYEMP(pS)EGG-NH2，即α-syn蛋白C端，本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)；SN16：anti-N-terminal-α-syn，兔源多克隆抗體 (免疫肽段Ac-CTKEGVVHGVAT-NH2，第44～54位氨基酸，即α-syn蛋白N端),本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)；Wako: 129位絲氨酸磷酸化α-syn抗體，鼠源單克隆抗體(貨號(hào)： pSyn#64，Wako 公司，日本); 總α-syn抗體，鼠源單克隆抗體(貨號(hào)：610786，BD公司，美國(guó))；小鼠源堿性磷酸酶標(biāo)記二抗mAP-IgG (貨號(hào)：#7056，Cell Singnal Tecnology 公司，美國(guó))；小鼠源銪元素標(biāo)記二抗mEu-IgG (貨號(hào)：AD0124，Perkin Elmer 公司，美國(guó))；4-氧代壬烯醛(4-oxo-2-nonenal, ONE，貨號(hào)：10185-1,Cayman公司，美國(guó))； 雙金雞納酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：23227，Pierce 公司，美國(guó))；考馬斯亮藍(lán)染液(貨號(hào)：21003, Biotium公司，美國(guó))；人凝血酶(貨號(hào)：27-0846-01,GE公司，美國(guó))；polo 樣激酶3(polo-like kinase 3,PLK3,貨號(hào)：SRP0361，PLK3, Sigma 公司，美國(guó))；p-硝基苯磷酸二鈉(p-nitrophenyl phosphate disodium hexahydrate，pNPP,貨號(hào)：P7998，Sigma 公司，美國(guó))。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備

實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功構(gòu)建了人源 GST-h-α-syn 的融合蛋白重組質(zhì)粒 pEGX-4T-1-h-α-syn[7]。根據(jù)文獻(xiàn)[2, 8]方法，IPTG 誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，裂解菌體后提取重組蛋白，隨后使用人凝血酶行GST 標(biāo)簽切割，經(jīng)純化柱洗脫，收集蛋白樣品，得到單體α-syn純蛋白，經(jīng)濃縮柱濃縮至4 000 μg/mL。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，取濃縮后的α-syn蛋白 25 μL，加入 1.5 μL PLK3，0.7 μL ATP，工作液47.8 μL，于30 ℃恒溫反應(yīng) 3 h，-80 ℃ 冰箱終止反應(yīng)，得到p-α-syn單體。使用α-syn和p-α-syn單體，經(jīng)ONE誘導(dǎo)聚集制備出α-syn聚集體(aggregates of α-syn,OW)和磷酸化α-syn聚集體(aggregates of p-α-syn,OP)[10]：各取 50 μL已經(jīng)制備完成的α-syn 和 p-α-syn 純蛋白，分別加 1.5 μL ONE (5 mg/mL)，混勻后37 ℃避光孵育 18 h。隨后行考馬斯亮藍(lán)染色和Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其純度。

1.4 DELFIA法檢測(cè)

每孔加入按一定比例稀釋的捕獲抗體(SN16) 100 μL，4 ℃冰箱過(guò)夜，隨后使用200 μL PBST洗板3次，每次5 min。隨后每孔加入1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA 100 μL，于 37 ℃搖床孵育 2 h，每孔中加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)抗原α-syn、p-α-syn、OW、OP，于 37 ℃搖床孵育 2 h。清洗后，每孔中加入100 μL C140S抗體，于 37 ℃搖床孵育 2 h后清洗，每孔加入100 μL Eu3+-IgG二抗，37 ℃搖床孵育20 min, 最后每孔加入200 μL 增強(qiáng)緩沖液，于37 ℃搖床孵育30 min。用多功能讀板儀找到DELFIA?模塊，讀取每孔的信號(hào)值(TRF signal)，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。間接法DELFIA檢測(cè)方法使用檢測(cè)抗原進(jìn)行96孔板包被，使用C140S抗體結(jié)合后，隨后步驟同雙抗夾心DELFIA法。

1.5 ELISA法檢測(cè)

包被和加入檢測(cè)抗體的步驟同DELFIA法，洗滌檢測(cè)抗體后，加入堿性磷酸酶(AP)-IgG二抗，孵育 1 h，隨后加入100 μL 顯色底物 pNNP，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀在405 nm，0.1 s 讀取每個(gè)孔道的A值。

1.6 Western blotting法檢測(cè)

采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，行SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉 1 h，分別加入一抗， 4 ℃ 孵育過(guò)夜。TBST 洗膜 3 次，放入相應(yīng)熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次，Odyssey 掃描儀成像，Image J分析條帶灰度值。

1.7 DELFIA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中的OP

水合氯醛麻醉小鼠后內(nèi)眥取血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，離心機(jī)4 ℃，2 500 g離心20 min，收集上清即血漿，按1∶2 000比例稀釋后，運(yùn)用SN16-C140S 配對(duì)的DELFIA-ELISA法檢測(cè)血漿中OP信號(hào)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 制備人源α-syn、p-α-syn、聚集體OW及OP純蛋白

大腸桿菌過(guò)表達(dá)人源α-syn質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)純化柱洗脫后，收集到3 管 α-syn 蛋白洗脫液，根據(jù)收集順序標(biāo)記為Elution 1、2、3?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果(圖1A)顯示，只在α-syn單體的相對(duì)分子質(zhì)量大小位置17 000出現(xiàn)蛋白條帶，純化的α-syn 蛋白純度高，且主要為單體形式。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)PLK3催化后的p-α-syn能被識(shí)別p-α-syn的抗體(Wako)識(shí)別，總α-syn能被識(shí)別總蛋白抗體(α-syn antibody，BD)識(shí)別(圖1B)，且均為單體形式。體外催化和聚集的OW和OP行Western blotting法檢測(cè)(圖1C)，OW和OP均以聚集體的形式存在，OP只能被識(shí)別p-α-syn的抗體(Wako)識(shí)別，OW和OP均能被BD識(shí)別，單體處無(wú)明顯條帶。這4種形式的蛋白純化成功，可以用做標(biāo)準(zhǔn)抗原。

圖1 人源α-syn蛋白單體及磷酸化α-syn單體，α-syn聚集體及磷酸化α-syn聚集體蛋白制備Fig.1 Preparation of human α-synuclein protein monomer (α-syn), phosphorylated α-syn monomer (p-α-syn), OW and OPA： CBS staining results showed the purity of α-syn； B： Western blotting results showed monomer α-syn and p-α-syn could be recognized by BD antibody and Wako antibody； C： Western blotting results showed OW and OP could be recognized by BD antibody and OP could be recognized by Wako antibody； OW： aggregates of α-syn; OP： aggregates of p-α-syn； CBS： Coomassie brilliant blue staining； BD： α-syn antibody； Wako： p-α-syn antibody.

2.2 DELFIA檢測(cè)體系捕獲抗體及檢測(cè)抗體的驗(yàn)證

Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)室前期制備的α-syn/N端多克隆抗體SN16 對(duì)α-syn、p-α-syn、OW、OP這4種形式的蛋白均可識(shí)別 (圖2A)。間接AP-ELISA結(jié)果顯示SN16 對(duì)于不同形式的α-syn 都具有識(shí)別能力，且對(duì)OP和OW的識(shí)別效果好于單體(圖2B)。隨后進(jìn)行p-α-syn抗體的選擇和驗(yàn)證，本研究選用3種識(shí)別 p-α-syn的抗體，包括 Wako 公司市售的p-α-syn抗體(Wako)，以及實(shí)驗(yàn)室前期自制的p-α-syn抗體克隆號(hào)分別為C140S和C48S。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，C140S、C48S和Wako抗體均不識(shí)別非修飾的α-syn和OW，特異性識(shí)別p-α-syn單體及OP，在相同條件下，C140S和Wako抗體對(duì)OP的識(shí)別效果好于C48S抗體(圖2C)。間接AP ELISA結(jié)果(圖2D)顯示3種抗體均不識(shí)別非修飾的α-syn和OW,特異性識(shí)別單體p-α-syn和OP，相同濃度下，C140S效價(jià)較C48S高，因此，選擇C140S作為檢測(cè)p-α-syn的檢測(cè)抗體。

圖2 捕獲抗體及檢測(cè)抗體的驗(yàn)證Fig.2 Capture antibody (SN16) and detection antibody (C140S) provedA： Western blotting showed the SN16 could discriminate the four different antigens including α-syn, p-α-syn, OW and OP； B： Indirect AP-ELSIA results showed the SN16 could detect the four different antigens； C： Western blotting showed the C140S could discriminate the two antigens including p-α-syn and OP； D： Indirect AP-ELSIA results showed the C140S could detect the two antigens including p-α-syn and OP； OW： aggregates of α-syn; OP： aggregates of p-α-syn； Wako： p-α-syn antibody; ELSIA：enzyme-linked immunosorbent assay.

2.3 DELFIA法初步驗(yàn)證C140S識(shí)別p-α-syn 和OP的效率

間接DELFIA法結(jié)果顯示，C140S不識(shí)別非修飾的α-syn和OW，能特異性識(shí)別 p-α-syn 單體及OP，檢測(cè)熒光值(time resolved flurescence,TRF)在100以上 (圖3A)。隨后，進(jìn)行了Eu-IgG的工作濃度篩選，在每次實(shí)驗(yàn)中設(shè)置2個(gè)復(fù)孔取平均值，結(jié)果顯示Eu-IgG在1∶1 000稀釋比例時(shí)信號(hào)檢測(cè)值較高，對(duì)p-α-syn 和OP的識(shí)別信號(hào)值均在100以上(圖3B)。隨后，在雙抗夾心體系：SN16作為檢測(cè)抗體，C140S作為捕獲抗體行DELFIA顯色來(lái)檢測(cè)其對(duì)p-α-syn 和OP的識(shí)別能力，SN16-C140S配對(duì)體系對(duì)OP的識(shí)別能力更好，對(duì)p-α-syn 單體識(shí)別信號(hào)值較差(圖3C)。

圖3 DELFIA法驗(yàn)證C140S抗體識(shí)別抗原的類(lèi)型Fig.3 DELFIA results showed the type of antigen recognized by C140SA： Indirect DELFIA results showed the detecting ability of C140S to α-syn, OW, p-α-syn and OP； B： Different dilute Eu-IgG showed the detecting ability of C140S to p-α-syn and OP； C： Sandwich SN16-C140S DELFIA results showed the detecting ability of C140S to p-α-syn and OP； DELFIA: dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay; OW： aggregates of α-syn； OP： aggregates of p-α-syn; TRF：time resolved flurescence.

2.4 雙抗夾心DELFIA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

因此本研究中標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度分別為0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 ng/mL，OW作為陰性對(duì)照。采用Eu3+-DELFIA法建立監(jiān)測(cè)OP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，與TRF信號(hào)值呈線性關(guān)系的抗原濃度范圍為0.625～20 ng/mL(圖4A)，將此抗原濃度范圍與TRF值得出DELIFA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=1，圖4B)，其R2=0.992 8，雙抗夾心DELIFA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功。

圖4 雙抗夾心DELFIA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.4 Establishment of standard curve of sandwich DELFIAA： Curve picture showed the relationship between the antigen concentration and TRF signal values using DELFIA rectangle showed the linearity range； B： standard curve of sandwich DELFIA. DELFIA: dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay; OW： aggregates of α-syn； OP： aggregates of p-α-syn； TRF：time resolved flurescence.

2.5 雙抗夾心DELFIA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中的OP含量

使用Thy1-α-SYN轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩野生對(duì)照小鼠驗(yàn)證SN16-C140S DELFIA檢測(cè)方法能否檢測(cè)小鼠血漿中的 OP含量變化。Western blotting及灰度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Tg小鼠皮質(zhì)組織α-syn的表達(dá)量是Wt組的3.14倍(圖5A、B)(P<0.01,n=3)。隨后取6 月齡和 12 月齡小鼠血漿行1∶2 000稀釋?zhuān)褂肧N16-C140S配對(duì) DELFIA法檢測(cè)血漿中OP的信號(hào)值。結(jié)果顯示，Wt和Tg組小鼠血漿中OP的含量在12月齡均較6月齡有所增加(P<0.001)，Tg組6月齡小鼠血漿中OP含量顯著高于同月齡Wt組(P<0.001)，Tg組12月齡小鼠血漿OP較Wt組有增高的趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,n=10) (圖5C)，但兩個(gè)因素(分組和月齡)之間并沒(méi)有顯著的相互作用(F=0.487,P=0.490)。

圖5 雙抗夾心DELFIA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中的OP含量變化Fig.5 Sandwich DELFIA detected the plasma OP levels in Thy 1-α-SYN transgenic miceA： Western blotting of α-syn expression in Wt and Tg mice cortex at the age of 6 months; B： quantitative analysis of α-syn expression in the cortex (n=3). C： DELFIA results showed the plasma levels of aggregates of OP in Wt and Tg mice at 6-month and 12-month mice. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; DELFIA: dissociation enhanced lanthanide fluorescent immunoassay; OP： aggregates of p-α-syn；TRF：time resolved flurescence；Wt： wild type mice； Tg： Thy 1-α-SYN transgenic mice.

3 討論

DELFIA是一種應(yīng)用較多的時(shí)間分辨熒光分析(TRFIA)。鑭系元素銪(Eu3+)的激發(fā)光波長(zhǎng)為337 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm，其斯托克斯位移達(dá)278 nm，易于對(duì)激發(fā)光和發(fā)射光進(jìn)行波長(zhǎng)分辨，另外，Eu3+的熒光半衰期714 μs，較普通熒光團(tuán)時(shí)間長(zhǎng)。其基本原理為DELFIA中具有雙功能基團(tuán)的螯合物一側(cè)連接Eu3+，一側(cè)連接抗體，形成標(biāo)記免疫物，在Eu3+的增強(qiáng)液中與另一種螯合物結(jié)合，在協(xié)同劑的作用下，形成一個(gè)Eu3+在其內(nèi)部的保護(hù)性微膠囊(膠態(tài)分子團(tuán))，它在激發(fā)光下能發(fā)射出很強(qiáng)的熒光信號(hào)，與待測(cè)抗體的含量相關(guān)。傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)法受操作手法、前帶現(xiàn)象以及吸光值讀數(shù)低等因素影響導(dǎo)致檢測(cè)敏感度低，特異度差。DELFIA法作為一種新的非放射性免疫定量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了原子標(biāo)記，對(duì)標(biāo)志物的影響較小，因此有敏感度高、特異性強(qiáng)、其標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、可重復(fù)測(cè)量、不受樣品自然熒光干擾及無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。臨床上，DELFIA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種指標(biāo)的檢測(cè)，包括乙型肝炎血清標(biāo)志物、癌胚抗原等，也用于檢測(cè)克羅諾桿菌，促黃體生成素等各種生物樣本[11-12]。但是目前的研究中還未應(yīng)用DELFIA方法檢測(cè)PD患者血液樣本。

α-Syn有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端、NAC區(qū)和C端[7]，因此有針對(duì)不同區(qū)域的抗體。一般認(rèn)為生理情況下α-syn是單體形式存在的，當(dāng)在病理情況下會(huì)發(fā)生聚集，磷酸化等蛋白形式的變化，聚集形式的α-syn和p-α-syn被認(rèn)為是具有細(xì)胞毒性的[13]。本研究建立了一種使用DELFIA法檢測(cè)血液中OP的檢測(cè)體系，有較高的靈敏度和檢測(cè)范圍，使用此方法在Thy1-α-SNY轉(zhuǎn)基因小鼠中的檢測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)論在Tg組還是在Wt組，OP在血漿中的含量均會(huì)隨著月齡的增加而增多，并且Tg組小鼠OP的含量均較Wt組顯著增加。

研究[14]顯示，突觸核蛋白病(PD 和MSA)人血漿中α-syn是降低的，但是pS129-/t-α-syn 的比值增加。對(duì)PD患者的研究[15]顯示，在腦脊液和血液中α-syn的含量是降低的，但是α-syn聚集體的含量是增加的。在正常情況下，體內(nèi)p-α-syn的含量在4%以下，但是，在PD患者血中，129位絲氨酸p-α-syn顯著增加，并與運(yùn)動(dòng)癥狀損傷的嚴(yán)重相關(guān)[16]，是否是聚集形式的p-α-syn并沒(méi)有檢測(cè)。研究[17-18]顯示p-α-syn較α-syn更易于聚集和傳播。聚集的p-α-syn可能是表征疾病進(jìn)程的指標(biāo)之一，因此，除了檢測(cè)體內(nèi)p-α-syn的變化情況，檢測(cè)p-α-syn聚集體更加能反映出疾病的發(fā)展進(jìn)程。目前對(duì)于識(shí)別p-α-syn聚集體的抗體不多，也沒(méi)有應(yīng)用于血漿樣本的檢測(cè)。本研究建立的檢測(cè)體系中的C140S作為檢測(cè)抗體，經(jīng)Western blotting及ELSIA實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，較單體的p-α-syn，其對(duì)OP識(shí)別效率更好，并能反應(yīng)疾病的程度。

對(duì)血液、腦脊液、尿液等體液檢測(cè)是檢測(cè)疾病進(jìn)程的有效樣本，本研究只檢測(cè)小鼠血漿中OP的含量，下一步將建立小鼠腦脊液的檢測(cè)方法，以及在PD患者的血漿樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證其檢測(cè)效果，為PD早期診斷及判斷病程進(jìn)展提供新的檢測(cè)方法。