沈龍仙，張 晨，汪 涵，袁瓊雨，楊松柏，周曉龍，趙阿勇

（浙江農(nóng)林大學動物科技學院·動物醫(yī)學院，浙江臨安 311300）

光作為一種非生物因素，會影響動物的生長速率、代謝活動、性成熟和繁殖等，對大多數(shù)生物的生命有重要作用。延長日照時間可以增加魚類的生長速度[1]、影響肉雞的采食量和生長率，也會影響骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)生率[2]。肌肉的生長發(fā)育受一系列生肌決定因子時空上的精密調(diào)控，根據(jù)這些因子的結(jié)構(gòu)和作用模式可以分為相對獨立的家族，如生肌調(diào)控因子家族（MRFs）、肌細胞特異性增強因子2 家族（MEF2）、轉(zhuǎn)化因子β超家族（TGF-β）、配對框家族（Pax）等。然而，關(guān)于光照管理技術(shù)對肌肉生長發(fā)育的影響少有報道，其相關(guān)的作用機制還需要進一步研究。

鵝屬于季節(jié)性繁殖動物，光照對其影響很大。合適的光照程序可以通過延長產(chǎn)蛋期和縮短休產(chǎn)期來提高鵝的產(chǎn)蛋性能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，不同光照組之間的肌肉特異性基因表達會發(fā)生變化，表明魚類肌肉生長過程的調(diào)控機制依賴于光周期的持續(xù)時間[1]。因此，推測光照可能會影響浙東白鵝肌肉的生長發(fā)育。MLT 是一種由松果體分泌的多功能吲哚類激素，其分泌具有晝夜節(jié)律和季節(jié)性節(jié)律，并且對光照非常敏感。本試驗檢測了浙東白鵝在不同光照模式下的血清MLT 含量，通過實時熒光定量PCR 技術(shù)分析肌肉特異性基因表達的變化，發(fā)現(xiàn)MLT 含量發(fā)生了顯著變化，因此在C2C12 細胞上開展了一系列初步實驗驗證MLT 對肌肉特異性基因的作用，為進一步提高家禽生長性能和促進肌肉生長發(fā)育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 總RNA 提取試劑Trizol（北京康為世紀生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 5X All-In-One RT Master Mix（南京曼夫特生物科技有限公司）；SYBR?Premix Ex TaqTM II 試劑盒（新貝生物科技有限公司）；C2C12 細胞（浙江農(nóng)林大學動物遺傳育種與繁殖實驗室）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司）；胰酶（0.25%Trypsin-EDTA 1X，Thermo Fisher 公司）；12 孔板和細胞培養(yǎng)皿（杭州昊鑫生物科技有限公司）。

1.2 動物試驗 試驗持續(xù)時間為2 個月，選取32 周齡體型大小相似、體況良好的浙東白鵝母鵝16 只，隨機分成2 組，每組8 只。2 個試驗組分別接受長光照（15L:9D）和短光照（9L:15D）。按正常的飼養(yǎng)管理模式進行，內(nèi)設(shè)飲水器，每天喂料2 次（07:00 和17:00）。盡量保持舍內(nèi)衛(wèi)生、干燥。自由采食、自由飲水。在40 周齡對其進行屠宰，每組隨機抽取4 只鵝，取靜脈血5 mL用于后續(xù)各項指標的檢測。同時取所有鵝的同側(cè)腿肌組織部位，置于液氮速凍，-80℃保存。

1.3 細胞培養(yǎng)實驗

1.3.1 C2C12 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 細胞復(fù)蘇：從液氮中迅速取出凍存的C2C12 細胞，放入提前預(yù)熱至37℃的水浴鍋中，不斷搖晃凍存管，在快要融化的時候取出，將細胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管內(nèi)，加入生長培養(yǎng)基吹打均勻，1 000 r/min 離心5 min。棄去上清液，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細胞。將其轉(zhuǎn)移至10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，置于含5% CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞傳代：培養(yǎng)瓶中的C2C12 細胞貼壁面積達到80%左右時，吸棄舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液PBS 清洗棄去，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細胞5 min 左右，加入1 mL 細胞終止液終止消化。吹打混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，1 000 r/min 離心5 min。吸棄上清液，加入生長培養(yǎng)基，將細胞吹打混勻，分裝至2 個10 cm 培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞鋪板：待細胞融合率達到80%時，吸棄舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液PBS 清洗棄去，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細胞5 min 左右，加入1 mL 細胞終止液終止消化。吹打混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min。吸棄上清液，加入生長培養(yǎng)基，將細胞吹打混勻，用12 孔板進行細胞鋪板，將細胞分組培養(yǎng)在含添加不同MLT 濃度（0、0.1、1.0、10 ng/mL）的DMEM 高糖培養(yǎng)基中。

1.3.2 體外培養(yǎng)C2C12 細胞不同時期的RNA 提取 細胞鋪板24 h 后收集提取各組細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后置于-20℃凍存。以GAPDH為內(nèi)參基因，對肌肉發(fā)育相關(guān)基因進行熒光定量PCR 檢測分析。

選擇適宜的褪黑素濃度進行C2C12 細胞培養(yǎng)，將細胞分組培養(yǎng)在該濃度下的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，同時設(shè)置對照組培養(yǎng)在無褪黑素處理的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，收集提取30%、50%、70%、90%細胞融合度的細胞RNA，對其進行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 操作。

1.4 總RNA 的提取和cDNA 的合成 利用Trizol 法（Trizol Reagent，Invitrogen）提取實驗鵝腿肌組織的總RNA。以1% 瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測RNA 的純度和濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA 的合成利用5X All-In-One RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Abm，Canada）。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：5X All-In-One RT MasterMix 4 μL，RNA 1 ng，Nuclease-free H2O 加到20 μL。反應(yīng)條件為25℃10 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 保存。反應(yīng)完成后取出加40 μL dd H2O 稀釋，-20℃保存。

1.5 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 公布的mRNA 序列，采用Primer Premier 5.0 軟件對肌肉特異性相關(guān)基因以及內(nèi)參基因GAPDH進行引物設(shè)計（表1、2）。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 鵝肌肉特異性基因PCR 擴增引物

1.6 實時熒光定量PCR 將反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 模板，加入已驗證好的引物，根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR 檢測，每個樣本重復(fù)3 次。反應(yīng)體系10 μL：2×S6 Universal SYBR qPCR Mix5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.25 μL，Reverse Primer 0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL；qPCR 程序：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，進行 40 個循環(huán)，擴增結(jié)束后分析熔解曲線。每個樣本進行3 次實時PCR 檢測，取平均值。

表2 鼠肌肉特異性基因PCR 擴增引物

1.7 統(tǒng)計分析 本次實驗以GAPDH 基因作為內(nèi)參基因?qū)z測的目的基因進行歸一化，采用 2-ΔΔCt法得出不同光照時間下浙東白鵝肌肉特異性基因的相對表達量，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，使用LSD 法進行差異顯著性檢驗。差異顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 不同光照對體重和褪黑素含量的影響 如圖1 所示，長光照組的平均體重為3.86 kg，較短光照組下降了14.41%（P＜0.05）。短光照組體內(nèi)血清的褪黑素含量（431.29 ng/L）較長光照組（377.94 ng/L）顯著提高。

圖1 2 種光照制度下浙東白鵝的平均體重和血清內(nèi)的褪黑素含量

2.2 光照對鵝肌肉特異性基因表達的影響 RT-qPCR 結(jié)果顯示，在實驗期間，所有基因的表達水平都發(fā)生了變化。由圖2 可知，短光照組中Pax7、Pax3、Myf6、MSTN基因表達高于長光照組（P＞0.05），其中Myf5基因的表達高于長光照組（P＜0.05）。而長光照組中MyoG、MyoD基因的表達高于短光照組（P＞0.05）。

圖2 2 種光照制度下浙東白鵝肌肉特異性基因mRNA 的表達

2.3 不同MLT 濃度處理C2C12 細胞后肌肉特異性基因的表達 圖3 結(jié)果顯示，Myf5基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達低于0 ng/mL 組（P＜0.01），而且Myf6基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達低于0 ng/mL 組（P＜0.05），其他基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達雖然沒有顯著差異，但都呈下降趨勢。相反，各個基因在0.1、1 ng/mL 處理組的表達與0 ng/mL 組均無顯著變化。2.4 C2C12 細胞的培養(yǎng) 圖4 顯示的是細胞融合度達到30%、50%、70%、90%的10 ng/mL MLT 處理組和0 ng/mL MLT 處理組的細胞形態(tài)。圖中可以看出，當細胞融合度達到70% 或90% 時，10 ng/mL MLT 處理組的細胞形態(tài)比0 ng/mL MLT 處理組的更為纖長。

圖3 不同濃度處理下小鼠成肌細胞C2C12 中特異性基因的表達

圖4 C2C12 細胞的增殖過程

2.5 10 ng/mL MLT 處理C2C12 細胞后肌肉特異性基因的表達譜 從圖5 可以看出，細胞融合度達到30%、50%、70%、90% 時肌肉發(fā)育基因在10 ng/mL MLT 處理組的表達都低于0 ng/mL MLT 處理組（P＞0.05），結(jié)果表明在一定條件下，10 ng/mL MLT 處理對C2C12細胞中的肌肉特異性基因有抑制作用。

圖5 10 ng/mL MLT 處理C2C12 細胞后肌肉特異性基因的表達譜

3 討論

3.1 光照對浙東白鵝體重的影響 家禽的眼睛對光非常敏感，光照是影響家禽生產(chǎn)力表現(xiàn)的主要環(huán)境因素之一，而體增重是評定家禽生產(chǎn)性能的一項重要指標。本試驗中短光照組的平均體重顯著高于長光照組，與前人的試驗結(jié)果不同。如王秋菊等[4]試驗表明，長日照對東北白鵝公鵝總增重沒有顯著影響，但對東北白鵝和浙東白鵝的總增重有顯著的促進增長作用。Schwean-Lardner 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，23 h 光照飼養(yǎng)下肉雞的體增重小于17 h 光照飼養(yǎng)下的肉雞體增重，說明延長光照時間不一定促進家禽生長。也有研究發(fā)現(xiàn)不同光照時間不會影響家禽體重。石雷等[6]研究證實，4 種光照節(jié)律下的肉雞平均體增重無顯著差異，可能是因為長時間的光照使肉雞興奮性增強，加大活動力度，從而導致體增重的差異。另外，不同的研究學者采取的試驗條件不同，包括品種、光照時間和恒定光強度的選擇，以及季節(jié)導致的溫度差異均會影響試驗結(jié)果。研究表明，不同雞種體重存在顯著差異，其肌肉中骨骼肌衛(wèi)星細胞的數(shù)量及細胞大小也有顯著差異，且骨骼肌衛(wèi)星細胞分化也有顯著差異[7]。

3.2 褪黑素、光照對浙東白鵝肌肉生長發(fā)育的影響 從上述結(jié)果可以看出，長光照組的平均體重和血清中MLT 含量均顯著低于短光照組，表明光照對浙東白鵝的體重和體內(nèi)MLT 含量有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)松果體能將光信號轉(zhuǎn)換為褪黑素信號，進而調(diào)節(jié)動物機體的免疫、激素的合成以及生殖等生理活動，并且光周期、光強度和光波長均能影響家禽MLT 的分泌[8]。Calvo-Guirado 等[9]研究表明，MLT 可以促進大鼠脛骨植入中新骨的生長。Natalia 等[10]研究表明，添加10～100 ng/mL MLT 可以促進雞胚原代衛(wèi)星細胞的增殖。以上數(shù)據(jù)表明，MLT 對肌肉生長發(fā)育有顯著影響。

3.3 光照對浙東白鵝肌肉特異性基因表達的影響MRFs 包 括Myf5、MyoD、Myf6或MRF4和MyoG，其中Myf5和MyoD主要參與成肌細胞的增殖；MyoG在胎兒發(fā)育中起作用，并且主要在分化末期表達；而Myf6主要在出生后表達，參與肌細胞的最終分化及肌纖維的維持。Pax3和Pax7同屬于Pax基因家族的第三亞家族，是生肌過程中主要的上游調(diào)控因子。Pax3主要調(diào)控早期胚胎的肌發(fā)生，而Pax7主要與肌肉損傷的修復(fù)有關(guān)，在這兩個過程中另一方扮演輔助角色。肌肉生長抑制素（MSTN）為TGF-β超家族成員，對骨骼肌生長起負調(diào)控作用。成年家畜的肌肉生長能力在胚胎時期就已決定[11]。但這些生肌決定因子的相關(guān)機制仍未不清楚。

肌肉的生長發(fā)育受上述因子調(diào)控，同時這些因子也存在廣泛的相關(guān)性。陳禧[12]研究發(fā)現(xiàn)，在出生后母鴨胸肌中，Pax3、Pax7、MyoD和Myf5具有廣泛的相關(guān)性，幾乎任意兩基因的表達水平均呈顯著或極顯著相關(guān)。Pax7基因與Pax3基因相互作用，通過誘導MyoD和Myf5基因的表達來參與骨骼肌的發(fā)育[13]。研究表明，MyoD和Myf5之間可能存在負反饋調(diào)節(jié)，Myf5促進MyoD基因的表達，而MyoD又抑制Myf5基因的表達[14]。在MyoG缺失的動物肌肉中Myf6 水平顯著增加，這在一定程度上具有代償作用[15]。因此本試驗中肌肉特異性基因表達的變化結(jié)果應(yīng)該結(jié)合起來分析，長光照組中Myf5基因的表達顯著降低，而MyoD的表達在長光照組有上升趨勢但并不顯著，與前人結(jié)果類似[14]。而且Myf6基因的表達在長光照組有下降趨勢，MyoG基因在長光照組有上升趨勢，本試驗推測兩者之間可能存在代償作用。目前關(guān)于肌肉特異性基因功能的研究尚不清楚，還需要進一步探索。

骨骼肌快肌和慢肌的上游調(diào)節(jié)因子Pax7和Pax3是重要的肌源性誘導物，在骨骼肌的發(fā)展和更新過程中起重要作用。Pax7基因是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化。Pax7與肌肉的生長和修復(fù)密切相關(guān)，在衛(wèi)星細胞的特化、增殖和激活過程中都有表達[16]。研究證實Pax3的持續(xù)表達可以抑制肌細胞分化，表明Pax3表達下降是成肌過程持續(xù)進行的必要步驟[12]。Pax3對胚胎期動物四肢的正常生長和發(fā)育至關(guān)重要，而Pax7更傾向于參與骨骼肌損傷修復(fù)的過程[17]?？赡苁且驗镻ax7、Pax3分別在骨骼肌損傷修復(fù)和胚胎發(fā)育期起作用，在生長后期兩者的表達會下調(diào)，因此本試驗中Pax7、Pax3基因的表達并沒有受光照調(diào)控的趨勢。

研究發(fā)現(xiàn)Myf5在脊椎動物的生肌過程中扮演重要角色[18]。其表達水平通常在孵化時最高，然后隨年齡增加而下降[19]。本試驗中，長光照組中Myf5基因的表達較短光照組顯著下調(diào)，表明光照對Myf5基因的表達有顯著影響。Myf6基因主要參與出生后肌肉分化的過程，并在成肌細胞的持續(xù)分化過程中起重要的調(diào)控作用，且在整個生長過程中保持相對較高的表達水平[20]。本試驗中，Myf6基因的表達相對其他基因呈現(xiàn)出較高的表達水平，但長光照組和短光照組的Myf6基因表達沒有顯著差異，可能是因為Myf6基因的表達不受肌肉類型、年齡和品種的影響[21]。

MyoG在成肌細胞融合為肌纖維的過程中起調(diào)節(jié)作用，是肌細胞終末分化的關(guān)鍵因子。Patruno 等[22]研究了長白豬在胚胎期高表達MyoG，出生后呈低表達的穩(wěn)定趨勢。需要考慮的是，在不同種類的動物中，同種動物的不同發(fā)育時期，同種動物的不同類型的肌肉組織，同種細胞的不同狀態(tài)下MyoG基因轉(zhuǎn)錄水平的表達具有不同規(guī)律[23]。目前MyoG在禽類胚胎發(fā)育過程中肌肉組織中的發(fā)育性表達特性的研究比較少。本研究中長光照組MyoG基因的表達略高于短光照組，但沒有顯著趨勢，鑒于MyoG基因在鵝早期增重發(fā)揮調(diào)控作用[24]，猜測MyoG基因在浙東白鵝產(chǎn)蛋期的表達水平可能已經(jīng)穩(wěn)定，并且不受光照影響。

MyoD能促進各種類型細胞轉(zhuǎn)化為成肌細胞，是肌肉組織形成的調(diào)節(jié)決定因子。肌肉中MyoD與Myf5表達相似，都是先升高后降低[25]。MyoD基因的過表達會抑制成肌細胞的增殖，并促進成肌細胞分化為成熟的肌纖維細胞[26]。本試驗中MyoD基因的表達在長短光照組中均不顯著，表明此試驗中MLT 對MyoD基因表達沒有影響。

MSTN是一種對骨骼肌生長具有負調(diào)控作用的細胞因子，其突變或缺失會導致肌細胞增生和肌纖維肥大[27]。研究報道，肌肉生長性狀表現(xiàn)迥異的蛋雞和肉雞MSTNmRNA 表達量并無明顯差異，表明單一個MSTN基因不足以解釋禽類機體正常生長過程中肌肉的生長情況，而應(yīng)與其他基因結(jié)合分析[28]。研究發(fā)現(xiàn)，MRFs 家族不同成員在肌肉生長時先后表達，促進肌細胞增殖、分化，而MSTN可通過調(diào)控MRFs 抑制肌肉生長發(fā)育[29]。本試驗中，MSTN基因的表達水平相對較低，MRFs 家族的成員表達水平較高，表明機體可能處于促進肌肉生長發(fā)育的趨勢。王錢保[30]研究證實，淮南麻黃雞的MSTN基因表達量與體重呈顯著負相關(guān)。Zhang 等[31]研究顯示，MSTN基因的多態(tài)性對邊雞6～18 周齡的體重有顯著影響。本試驗中MSTN基因在長光照組中的表達略低于短光照組，但無顯著差異，而長光照組的體重顯著低于短光照組，說明MSTN基因的表達與體重沒有顯著關(guān)系。

3.4 褪黑素對小鼠成肌細胞發(fā)育基因表達的影響 本研究發(fā)現(xiàn)10 ng/mL MLT 對C2C12 細胞中的肌肉特異性基因有抑制作用。有研究表明在C2C12 成肌細胞系中添加1～2 mmol/L 褪黑素能誘導自噬從而降低MyoD[32]。但本試驗結(jié)果顯示，在C2C12 細胞中添加MLT 并沒有顯著降低MyoD基因的表達水平，可能是因為濃度不一，或是自噬導致的MyoD的下調(diào)所致。后續(xù)試驗將利用浙東白鵝腿肌細胞進行不同的MLT 濃度處理實驗，并且在之前細胞增殖實驗的基礎(chǔ)上再增加骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化實驗，進一步探測各個基因的相關(guān)調(diào)控機制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)Myf5基因在長光照組中呈顯著下調(diào)趨勢，其他基因沒有顯著變化；C2C12 細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)添加適宜濃度（10 ng/mL）的MLT 對肌肉特異性基因有抑制作用；Myf5基因在10 ng/mL MLT 組的表達極顯著低于0 ng/mL MLT 組，Myf5基因可能是光照通過褪黑素影響肌肉發(fā)育的一個關(guān)鍵基因，其他基因的作用需要進一步研究。