徐曉東，吳立坡，姜 寧，曹 陽，潘春媛，李凌巖，陳 勇，張愛忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

我國是農(nóng)業(yè)大國，在糧食高產(chǎn)的同時(shí)也產(chǎn)生了大量的農(nóng)作物秸稈，然而農(nóng)作物秸稈具有低能低蛋白、高纖維等特點(diǎn)，直接用作飼料時(shí)適口性差、利用率低、瘤胃降解率低，限制了秸稈資源在反芻動物粗飼料中的應(yīng)用，所以我國農(nóng)作物秸稈飼料年利用率不足30%[1]。若能合理地將秸稈作為飼料使用則可以降低飼料成本，提高養(yǎng)殖的效益。黃孢原毛平革菌是白腐真菌的一種，其分泌的胞外酶可降解秸稈中的木質(zhì)素，使原本被木質(zhì)素包裹的纖維素、半纖維素釋放出來[2]，而纖維素酶、木聚糖酶可直接或間接通過物理或化學(xué)的作用使秸稈纖維結(jié)構(gòu)得到膨脹和破壞[3]，經(jīng)發(fā)酵后的秸稈，其粗纖維含量會大幅度下降[4]。魏志文等[5]用白腐真菌混合發(fā)酵玉米秸稈后其粗蛋白質(zhì)平均含量達(dá)到21.87%。濾紙纖維的聚合度和結(jié)晶度能夠較為真實(shí)地反映天然纖維素的情況。在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常以纖維濾紙作為底物來測定微生物對纖維素的降解能力，其優(yōu)點(diǎn)在于可直接用肉眼觀察濾紙片崩解程度，如果裂解程度比較明顯，大致可以認(rèn)為這種微生物具有較好的降解功能。李林超等[6]通過濾紙崩解試驗(yàn)在多個菌種中篩選出了降解效果最佳的2 株菌種。本試驗(yàn)擬通過濾紙條崩解試驗(yàn)觀察真菌、酶制劑分解纖維素的效果，進(jìn)一步篩選發(fā)酵玉米秸稈條件，觀察不同處理方法對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響，為玉米秸稈飼料化的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 濾紙崩解培養(yǎng)基：KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，酵母粉0.01 g，H2O 100 mL。121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3 g，葡萄糖20 g，瓊脂14 g。

黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1 L，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1微量。121℃滅菌15 min。

1.1.2 菌種和酶 黃孢原毛平革菌（CICC 40299，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）活菌數(shù)1×108個/mL；纖維素酶酶活≥10 000 U/g，木聚糖酶酶活≥30 000 U/g，均為寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 玉米秸稈 玉米秸稈收購于大慶市周邊的農(nóng)戶，在自然風(fēng)干后用粉碎機(jī)將其切短到2～4 cm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 菌種活化：將黃孢原毛平革菌凍干菌粉接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)5 d，并轉(zhuǎn)接活化2 次，放于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

液體菌種培養(yǎng)：將黃孢原毛平革菌接種到液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，然后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌種的孢子濃度大致控制在1×108個/mL。

1.2.2 濾紙條崩解試驗(yàn) 將滅菌好的培養(yǎng)基放入無菌操作臺備用，并按表1 分別添加濃度為0.2 g/L 的菌酶、纖維素酶和木聚糖酶，添加量為5 mL，黃孢原毛平革菌的接種量為20%。每個培養(yǎng)基中放入1/4φ12.5 cm 的扇形濾紙，搖勻使濾紙片平鋪在錐形瓶底部，封口，于30℃、100 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，隔天觀察，并記錄。

表1 濾紙崩解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 玉米秸稈發(fā)酵試驗(yàn) 試驗(yàn)以纖維素酶和木聚糖酶的添加量、黃孢原毛平革菌接種量、發(fā)酵天數(shù)為單因素，考察其對玉米秸稈綜合評分和中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）含量的影響，每組試驗(yàn)設(shè)3 個重復(fù)。將玉米秸稈裝入25 cm×35 cm 聚乙烯袋內(nèi)，每袋500 g，加入菌酶復(fù)合制劑后于30℃下進(jìn)行密封發(fā)酵，并設(shè)置空白對照組，并將水分控制在60%～70%。

纖維素酶組分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg纖維素酶，0.3 g/kg 木聚糖酶，20%的菌接種量，發(fā)酵21 d。木聚糖酶組分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg木聚糖酶，0.3 g/kg 纖維素酶，20%的菌接種量，發(fā)酵21 d。菌接種量組分別接入10%、15%、20%、25%、30% 菌液，0.3 g/kg 纖維素酶，0.3 g/kg 木聚糖酶，發(fā)酵21 d。發(fā)酵天數(shù)組加入0.3 g/kg 纖維素酶，0.3 g/kg木聚糖酶，20% 的菌接種量，分別發(fā)酵7、14、21、28、35 d。

1.2.4 菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵最佳條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量、菌接種量和發(fā)酵天數(shù)4 個因素，以發(fā)酵品質(zhì)的綜合評分和NDF、ADF、ADL 含量為評定標(biāo)準(zhǔn)，來確定復(fù)合菌酶制劑發(fā)酵的最佳條件。

1.2.5 pH 及纖維含量的測定 采用pH 計(jì)（FE28 型，由梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)）測定。NDF、ADF 和ADL 參考范氏洗滌纖維分析法[7]測定。

1.2.6 玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)評分 參考青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）[8]中的青貯玉米秸桿的評分標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2016 軟件整理數(shù)據(jù)，最佳發(fā)酵條件試驗(yàn)采用SPSS 16.0 軟件的 One-Way ANOVA、Duncan's 多重比較法進(jìn)行分析，發(fā)酵驗(yàn)證采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對濾紙條崩解的影響 從圖1-A 中可以看出，C2、C3 和C4 對濾紙均有一定的裂解作用，但裂解程度較差，到第5 天時(shí)還是有大片的濾紙塊存在；從圖1-B 中可以看到明顯的裂解現(xiàn)象，C8 到第5 天時(shí)搖瓶內(nèi)顏色略有變深，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，濾紙片完全裂解；其次是C7、C6 搖瓶內(nèi)培養(yǎng)基略顯變黃，仍存在小部分的碎片，C5 降解效果相對較差，搖瓶內(nèi)還有較多的小塊濾紙片存在。

圖1 不同處理方式對濾紙條崩解的影響

2.2 不同發(fā)酵條件對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.2.1 不同纖維素酶添加量對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響由表2 可見，纖維素酶添加量在0.2 g/kg 時(shí)綜合評分相對較高，接近優(yōu)質(zhì)發(fā)酵，該組pH 相對較低，pH 越低發(fā)酵品質(zhì)相對來說越好，其NDF 與ADF 高于0.1 g/kg 組（P＜0.05），與其他組差異不顯著；各組間ADL 差異不顯著。因此，纖維素酶添加量為0.2 g/kg 時(shí)較適宜。

表2 不同纖維素酶添加量下發(fā)酵玉米秸稈的綜合評分

2.2.2 不同木聚糖酶添加量對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響由表3 可以看出，木聚糖酶添加量在0.1 g/kg 時(shí)綜合評分相對較高，該組的pH 相對較低，接近優(yōu)質(zhì)發(fā)酵，其NDF 和ADF 低于其他各組（P＜0.05）；ADL 高于其他組（P＜0.05）。因此，木聚糖酶添加量為0.1 g/kg 時(shí)較適宜。

表3 不同木聚糖酶添加量下發(fā)酵玉米秸稈的綜合評分

2.2.3 不同菌接種量對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表4 可以看出，菌接種量在20%時(shí)綜合評分相對較高，該組的pH 相對較低，接近優(yōu)質(zhì)發(fā)酵，其NDF、ADF 和ADL 與10% 和15% 組差異不顯著，低于25%、30%各組（P＜0.05）；ADF 低于其他各組（P＜0.05）。因此，菌接種量為20%時(shí)較適宜。

表4 不同菌接種量下發(fā)酵玉米秸稈的綜合評分

2.2.4 不同發(fā)酵天數(shù)對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表5 可以看出，在發(fā)酵21 d 時(shí)的綜合評分相對較高，該組的pH 低于4.2，接近優(yōu)質(zhì)發(fā)酵，其NDF、ADF 和ADL低于發(fā)酵7 d 和14 d（P＜0.05），與發(fā)酵28 d 和35 d差異不顯著。因此，發(fā)酵天數(shù)為21 d 時(shí)較適宜。

表5 不同發(fā)酵天數(shù)下發(fā)酵玉米秸稈的綜合評分

2.3 復(fù)合菌酶制劑對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表6可知，試驗(yàn)組發(fā)酵的秸稈pH 低于對照組（P＜0.05），表明添加菌酶復(fù)合制劑可顯著降低發(fā)酵秸稈的pH；從色澤、氣味、質(zhì)地感官評價(jià)來看，試驗(yàn)組發(fā)酵的秸稈優(yōu)于對照組，其NDF、ADF 和ADL 低于對照組（P＜0.05）。綜合來看，試驗(yàn)組發(fā)酵的秸稈其發(fā)酵品質(zhì)明顯優(yōu)于對照組，并且屬于優(yōu)質(zhì)發(fā)酵。

表6 最佳條件下的發(fā)酵秸稈與未發(fā)酵秸稈的綜合評分

3 討論

本研究結(jié)果顯示，以C8（纖維素酶、木聚糖酶和黃孢原毛平革菌）組降解效果最佳，搖瓶內(nèi)顏色變深且濾紙片完全崩解，且菌酶復(fù)合組明顯優(yōu)于單一菌、酶的降解效果，說明菌酶復(fù)合制劑在纖維素的降解過程中有很好的協(xié)同作用，能夠加速對濾紙片的崩解，原因是濾紙經(jīng)過白腐真菌降解后其孔隙會增加，進(jìn)而增加了纖維素酶和木聚糖酶與濾紙的接觸面積，使濾紙中的纖維素和半纖維素快速酶解，所以菌酶復(fù)合添加比單一添加菌、酶的降解效果好。王元明[9]篩選出2 株能夠降解稻稈的菌株F1、F2，且兩者混合培養(yǎng)對濾紙的崩解效果更好。

水分是影響秸稈品質(zhì)的重要因素。當(dāng)水分過高時(shí)，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)滲出，降低了營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)會使秸稈發(fā)霉變質(zhì)；當(dāng)水分過低時(shí)，會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)流失，而且密封性差，不易形成無氧條件，容易造成需氧發(fā)霉。所以水分過高或過低都會導(dǎo)致青貯失敗[10]，因此發(fā)酵飼料的適宜含水量一般調(diào)整為60%～70%[11]。從本試驗(yàn)結(jié)果看，發(fā)酵結(jié)束后水分在62%～65%，水分調(diào)整的較好。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌的生長易受水分的影響[12]。適宜的水分可以濃縮可溶性碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，有利于提高細(xì)菌發(fā)酵和青貯品質(zhì)。

pH 決定了飼料最終發(fā)酵品質(zhì)的好壞及其營養(yǎng)損失的情況。本試驗(yàn)中，通過黃孢原毛平革菌、纖維素酶和木聚糖酶處理后的玉米秸稈其pH 迅速降低，與對照組差異顯著。pH 降低可能是因?yàn)辄S孢原毛平革菌固體發(fā)酵分泌的錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶等胞外酶通過破壞玉米秸稈中木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，釋放出被其包裹的纖維素和半纖維素，再通過高效的酶制劑降解纖維素和半纖維素，使秸稈內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，然后乳酸菌利用這些營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生大量乳酸，從而降低pH。白冰等[13]通過添加乳酸菌和纖維素酶對玉米秸稈進(jìn)行發(fā)酵，在30℃其pH 顯著下降。謝鳳蓮等[14]發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合益生菌和纖維素酶對艾草進(jìn)行發(fā)酵后，其pH 有顯著降低。萬江春等[15]發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌和纖維素酶青貯發(fā)酵棉花秸稈青，可以顯著降低棉花秸稈的pH，提高棉花秸稈的發(fā)酵品質(zhì)。

發(fā)酵秸稈的綜合評分能夠反映秸稈發(fā)酵品質(zhì)的好壞。本研究結(jié)果表明，添加菌酶復(fù)合制劑可顯著改善黃貯玉米秸稈的品質(zhì)，且發(fā)酵后的黃玉米秸稈具有酸味、疏松、不黏、淡黃色等特點(diǎn)。歐陽佳良等[16]研究結(jié)果表明，添加酶菌后可以顯著提高發(fā)酵秸稈的感官評價(jià)。古輝輝等[17]通過添加乳酸菌和纖維素酶對皇竹草進(jìn)行發(fā)酵后，其感官評價(jià)顯著高于對照組。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，以纖維素酶、木聚糖酶和黃孢原毛平革菌共同處理濾紙片的降解效果最好，在培養(yǎng)5 d后培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，濾紙片完全裂解；菌酶復(fù)合制劑發(fā)酵玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)較對照組顯著提升，使反芻動物可以更加有效低利用這些秸稈資源。本試驗(yàn)篩選出的最佳發(fā)酵條件為纖維素酶添加量0.2 g/kg、木聚糖酶添加量0.1 g/kg、黃孢原毛平革菌接種量20%、發(fā)酵天數(shù)21 d，在此發(fā)酵條件下玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)顯著高于對照組，且屬于優(yōu)質(zhì)發(fā)酵，其NDF、ADF 和ADL 分別比對照組降低了23.4%、20.13%、7.68%。