魏華凱，翟軍軍，關(guān)湘妍，曹思廣，張智源，杜春婧，張 群，王 騫，李井春*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000）

豬精液的保存方法主要有常溫液態(tài)保存和超低溫冷凍保存，目前生產(chǎn)實踐中以常溫液態(tài)保存為主，冷凍精液應(yīng)用還很少[1]，但是在常溫條件下保存精子的代謝強度比低溫條件高，在代謝過程中產(chǎn)生的活性氧會影響精子細(xì)胞的生理機能，很容易引發(fā)精子細(xì)胞自行凋亡，從而導(dǎo)致豬精子品質(zhì)顯著下降和精子畸形率上升。在精液稀釋液中添加抗氧化劑減少精子的氧化損傷成為提高豬精液保存效果的有效途徑之一。

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一，是一種天然抗氧化劑[2]。胡曉辰[3]研究表明，β-胡蘿卜素和維生素E 作為抗氧化劑均能夠防止精子質(zhì)膜上的不飽和脂肪酸被氧化，從而發(fā)揮抗氧化作用。但β-胡蘿卜素在豬精液常溫保存中的研究應(yīng)用鮮有報道。本實驗通過在Modena 稀釋液中添加不同濃度的β-胡蘿卜素并在17℃環(huán)境下保存豬精液，探討β-胡蘿卜素對17℃保存豬精液質(zhì)量的影響，為β-胡蘿卜素在豬精液保存中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 豬精液稀釋液配置 除特殊說明外，試劑藥品均為Sigma 公司產(chǎn)品。Modena 稀釋液[4]組成為每升溶液中含有葡萄糖13.75 g、檸檬酸鈉3.45 g、NaHCO30.5 g、EDTA-2Na 1.3 g、TRIS 2.825 g、檸檬酸1.45 g、青霉素0.3 g、鏈霉素0.5 g。β-胡蘿卜素（上海源葉生物科技有限公司）有效含量97%。以Modena 為基礎(chǔ)稀釋液，分別添加不同濃度β-胡蘿卜素分成5 組，即0 mg/L組（對照組）、10 mg/L 組、15 mg/L 組、20 mg/L 組、25 mg/L 組。各組稀釋液均在無菌操作臺配制，配制后使用0.22 μm 過濾膜進(jìn)行過濾滅菌，且在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 豬精液的準(zhǔn)備及處理 采集黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場健康無病的長白系4 頭種公豬的精液200 mL，進(jìn)行混合，37℃保存并及時送至實驗室。用配制好的稀釋液進(jìn)行稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)的方法在生物顯微鏡（南寧松景天倫生物技術(shù)有限公司）下檢測精子密度。用不同濃度實驗組稀釋液將原精密度配制成1×107個/mL，操作步驟環(huán)境為常溫，最然后將各處理組放在17℃恒溫箱保存待檢測。

1.3 精子質(zhì)量檢測 在17℃保存不同時間（0、1、2、3、4、5 d）內(nèi)各取20 μL 精子，升溫處理后（37℃條件下，活化10 min），用移液器將10 μL 精子滴在37℃恒溫板的載玻片上，制片后使用朗邁全自動精子分析儀檢查精子活率、活力、路徑速度等質(zhì)量參數(shù)，并做好記錄。

1.4 統(tǒng)計分析 利用Stat View 5.0 軟件對各項指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度β-胡蘿卜素對精子活率的影響 由表1 可知，隨著保存時間的延長，各組精子活率均呈逐漸下降趨勢，但10、15、25 mg/Lβ-胡蘿卜組在17 ℃保存1～3 d 與對照組無顯著差異；20 mg/Lβ-胡蘿卜組在保存0～1 d、5 d 與其他組無顯著差異，但在17℃保存2 d和5 d 時，20 mg/L 組的精子活率高于其他組（P＜0.05）。

表1 不同濃度β-胡蘿卜素對精子活率的影響

2.2 不同濃度β-胡蘿卜素對精子活力的影響 由表2 可知，隨著保存時間的延長，各組精子活力均呈逐漸下降趨勢。在17℃保存0～2 d 時各組間精子活力無顯著差異；17℃保存3 d 時β-胡蘿卜組精子活力高于對照組（P＜0.05）；17℃保存4 d 時20、25 mg/Lβ-胡蘿卜組精子活力高于其他3 組（P＜0.05）；保存5 d 時25 mg/Lβ-胡蘿卜組的精子活力高于其他組（P＜0.05）。

表2 不同濃度β-胡蘿卜素的稀釋液對精子活力的影響

2.3 不同濃度β-胡蘿卜素對精子路徑速度的影響 由表3 可知，隨著保存時間的延長，各組的精子路徑速度逐漸下降；在17℃保存3～5 d 時10、15、20、25 mg/Lβ-胡蘿卜素組精子路徑速度高于對照組（P＜0.05），且以20 mg/L 組最高；除保存5 d 時的25 mg/Lβ-胡蘿卜素組外，20 mg/Lβ-胡蘿卜素組的精子路徑速度均高于10、15、25 mg/Lβ-胡蘿卜素組（P＜0.05）。

表3 不同濃度β-胡蘿卜素的稀釋液對精子路徑速度的影響

2.4 不同濃度的β-胡蘿卜素對精子曲線速度的影響 由表4 可知，隨著保存時間的延長，各組精子的曲線速度逐漸下降；17℃保存0～2 d 時各組間沒有顯著差異，但保存3～5 d 時20 mg/L 組的精子曲線速度高于0、10、15、25 mg/Lβ-胡蘿卜素組（P＜0.05）。

表4 不同濃度β-胡蘿卜素的稀釋液對精子曲線速度的影響

2.5 不同濃度β-胡蘿卜素對精子鞭打頻率的影響 由表5 可知，隨著保存時間的延長，各組精子的鞭打頻率呈下降趨勢。保存2、5 d 時各β-胡蘿卜素組的精子的鞭打頻率均高于對照組（P＜0.05），4 個添加組間無顯著差異。在保存3 d 時只有15 mg/Lβ-胡蘿卜素組的鞭打頻率低于對照組（P＜0.05），而其他組無顯著差異。保存4 d 時各組間沒有顯著差異。

表5 不同濃度β-胡蘿卜素的稀釋液對精子鞭打頻率的影響

2.6 不同濃度β-胡蘿卜素對精子畸形率的影響 由表6可知，隨著保存時間的延長，各組的精子畸形率逐漸升高；17℃保存中20 mg/Lβ胡羅素組精子畸形率均低于對照組和其他添加組，特別是在第5 天時，20 mg/L 組顯著優(yōu)于其他組。

表6 不同濃度β-胡蘿卜素對精子畸形率的影響

3 討論

3.1β-胡蘿卜素對精子活率、精子活力、運動性能的影響β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素中活性最高的維生素A前體物，能在哺乳動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A[5]，具有較強的抗氧化能力[6]，但在豬精液常溫保存方面尚未投入應(yīng)用。精液保存是通過降低或抑制精子新陳代謝的強度，從而達(dá)到延長精子在體外存活的時間[7]。精子活率是一項重要的常規(guī)精液檢驗指標(biāo)，精子的運動性與受精能力存在相關(guān)性，是最重要的檢測指標(biāo)之一。本實驗結(jié)果表明，在精液稀釋液中添加適宜濃度的β-胡蘿卜素對17℃保存豬精液的精子活率、精子活力、路徑速度、曲線速度和鞭打頻率都有積極作用，但過量添加會降低精液品質(zhì)。

β-胡蘿卜素抗氧化能力強，高濃度的β-胡蘿卜素能夠降低或者抑制精子新陳代謝的強度[8]。在本實驗中，隨著β-胡蘿卜素添加濃度的增加，精子活率、精子活力、路徑速度、曲線速度、鞭打頻率呈下降趨勢，但適宜的濃度可以在一定程度上延緩精子活力或活率下降的程度，適當(dāng)延長精子的存活時間和提高精子的活力。

彭夏云等[9]研究表明，向豬精液稀釋液中添加茶多酚可對豬精子4℃低溫保存起較好的保護(hù)作用，可明顯提高低溫保存下豬精子活率、精子活力、路徑速度、曲線速度、鞭打頻率等運動參數(shù)。本實驗結(jié)果也表明，β-胡蘿卜素可以明顯提高在17℃保存條件下精子的路徑速度。精子冷卻、離心、冷凍、解凍等環(huán)節(jié)都會使活性氧增加[10]，過量的活性氧無法被反應(yīng)中和[11]，從而加速了精子質(zhì)量的下降。此外，在采精和稀釋過程中，外界環(huán)境或操作疏忽會使豬精液受到某些微生物的污染，從而對精液品質(zhì)造成影響[12-13]，推測由于實驗環(huán)境不恒定和實驗操作時外界因素不恒定導(dǎo)致檢測的實驗結(jié)果存在很大誤差，但研究表明添加β-胡蘿卜素對豬精子鞭打頻率沒有不利的影響。

3.2β-胡蘿卜素對精子畸形率的影響 本實驗結(jié)果顯示，隨著時間的推移，精子的畸形率不斷升高，其中20 mg/Lβ-胡蘿卜素組在保存1～5 d 的精子畸形率顯著低于對照組和其他添加組。β-胡蘿卜素作為抗氧化劑可以減少活性氧等物質(zhì)對精子細(xì)胞的氧化損傷[14]，保護(hù)精子，使精子存活時間得以延長、精子活力得到提高，畸形率上升減緩。綜合以上實驗結(jié)果可以看出，精液稀釋液中添加20 mg/L 的β-胡蘿卜素可顯著降低精子畸形率。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在17℃環(huán)境下，精液稀釋液中添加一定濃度的β-胡蘿卜素有利于豬精液保存，其中添加20 mg/L 的β-胡蘿卜素的精液稀釋液保存效果最佳。