魯瓊芬，陶 楊，蓋葉頂，李曉峰，楊紅玖，白榮芳，楊志新，李鵬飛，楊仁輝，余 燁，付斌龍，冷 靜*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；3.紅河縣迤薩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南紅河 654400；4.紅河縣畜牧科技推廣站，云南紅河 654400）

紅河黃牛屬于役肉兼用型地方品種，1981 年被錄入《紅河哈尼族彝族自治州畜禽品種志》。中心產(chǎn)區(qū)有紅河、彌勒、建水、瀘西、開遠(yuǎn)、石屏、元陽7 個縣（市），綠春、蒙自、個舊、金平、屏邊、河口6 個縣（市）也有分布[1]。關(guān)于紅河黃牛的起源有2 種說法，一種認(rèn)為其起源于短角亞洲原牛（Bos namadicus），一種認(rèn)為其與瘤牛（Bos indics）存在一定血緣關(guān)系，或許兩者都參與了紅河黃牛的形成[2]。紅河黃牛長期在山上、田間放牧飼養(yǎng)，活動量大，具有耐熱、耐旱、耐粗飼、抗蜱蟲等優(yōu)點(diǎn)。動物天然免疫系統(tǒng)可能對一些傳染性疾病存在完全或部分抗性，同時抗病品種和個體存在基因多態(tài)性。TLRs是一種普遍存在于哺乳動物巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中的跨膜蛋白家族[3]，與牛的多種疾病密切相關(guān)，可能與牦牛抵抗生殖系統(tǒng)的感染相關(guān)[4]。牛的BoIFN-γ有明顯的抗水泡性口炎病毒（VSV）的效果[5]，BoIFN-α對VSV 也具有明顯的抗性[6]。蔡進(jìn)忠等[7]研究表明牦牛BoIFN-α與傳染性支氣管炎病毒的抗性有關(guān)聯(lián)。BoLA-DRB3與乳房炎[8]、嗜皮菌病[9]、口蹄疫[10]等多種疾病的抗性和易感性有關(guān)。王昆[11]研究部分中國黃牛發(fā)現(xiàn)259 種DRB3*exon2 等位基因，其中秦川牛67 個、皖南牛72 個、溫嶺高峰牛64個、延邊牛77 個、功能性新等位基因?yàn)?20 個。通過對嗜皮菌病易感性相關(guān)最顯著的遺傳標(biāo)記DRB*09 和DQB*1804 基因進(jìn)行分析，采取標(biāo)記輔助選擇淘汰攜帶這類易感單倍型的牛，5 年內(nèi)嗜皮菌病的發(fā)病率由75%降到2%[9]。目前牛主要的抗病候選基因有SLC11A1、

TLR（TLR2、TLR4）、IFN（BoIFN-γ、BoIFN-α）、BoLA（牛MHC）等，其中SLC11A1位于2 號染色體，TLR（TLR2、TLR4）分別位于17、8 號染色體，IFN（BoIFN-γ、BoIFN-α）位于5、8 號染色體，MHC位于23 號染色體。紅河黃牛生長周期長，主要以散養(yǎng)放牧為主，但未見發(fā)生重要傳染病的流行，提示其生存能力和抗病力可能較強(qiáng)，決定其抗病力的免疫相關(guān)基因值得調(diào)查。本實(shí)驗(yàn)擬測定和分析放養(yǎng)條件下紅河黃?？共∠嚓P(guān)基因在不同組織的相對表達(dá)量，為發(fā)掘、利用紅河黃牛遺傳資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與樣品采集 選取飼養(yǎng)在紅河縣的12 頭公牛，其飼養(yǎng)管理均為早上9:00 左右至下午18:00 左右，在附近田間或山上放牧，晚上回圈舍休息。牧草品種有馬唐、牛筋草、狗尾巴草等。12 月至次年3 月，補(bǔ)飼干稻草、秸稈、甘蔗稍等農(nóng)副產(chǎn)品，其他時間均不補(bǔ)飼。組織樣品采集選取12 月齡、36 月齡和60 月齡放牧紅河黃牛公牛，每個月齡各3 頭，采集心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)和背最長肌7 個組織樣品，每個樣品含3 個重復(fù)，分裝于5 mL 凍存管，放入液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存待測。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 微量移液器（Thermo Scientific）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、超低溫冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、普通PCR 儀（北京中科盟科技有限公司）、電子分析天平（上海恒剛儀器儀表有限公司）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海穩(wěn)壓器廠）、水平電泳槽（濟(jì)南好來寶醫(yī)療器材有限公司）、凝膠電泳成像儀（上海金鵬分析儀器有限公司）。總RNA 提取液RNAiso Plus（寶生物技術(shù)公司）、核酸染料GELVEW（上海李記生物科技有限公司）、Loading buffer（上海尚寶生物科技有限公司）、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（廣州勵德生物科技有限公司）、無水乙醇、瓊脂糖、TB Green Premix EX Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（寶生物技術(shù)公司）、0.2 mL熒光定量八排管（含蓋）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織中總RNA 提取 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。RNA 質(zhì)量檢測采用紫外分光光度計(jì)法，OD260/OD280=1.8～2.0 即視為合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄 以總RNA 為模板合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系采用40 μL，步驟按試劑盒說明書操作。

1.3.3 熒光定量PCR 根據(jù)NCBI Genbank 數(shù)據(jù)庫收錄的各基因mRNA 序列，用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，引物具體信息見表1。以β-actin 基因作為內(nèi)參。

表1 抗病基因引物

實(shí)時熒光定量采用20 μL 反應(yīng)體系：SYBRPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物（0.4 μmol/L）各0.8 μL，cDNA（100～500 ng/μL）2 μL，dH2O 6.4 μL。使 用 熒光定量PCR 儀進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，39 個循環(huán)，添加1 個溶解曲線，設(shè)置以dH2O 為模板的陰性對照，每個組織進(jìn)行3 次重復(fù)擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有樣品以β-actin 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正處理，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的表達(dá)量（n=3），先用Excel 2007 整理原始數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 氏法多重比較，P＜0.05 判為組間差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 總RNA 提取結(jié)果 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，其28S、18S rRNA 條帶清晰可見（圖1）。取1 μL RNA 進(jìn)行濃度測定，OD 值均滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 紅河黃牛不同組織總RNA 提取的電泳分析

2.2 熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線和溶解曲線 通過熒光定量PCR 反應(yīng)所獲得的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)“S”形，平整統(tǒng)一，平行性好，滿足實(shí)驗(yàn)要求；溶解曲線均具單一峰值，無雜峰，表明樣品重復(fù)性好，引物特異性較好，無引物二聚體出現(xiàn)。結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可做下一步分析。

2.3 不同月齡紅河黃牛抗病基因在不同組織中的表達(dá)量分析

圖2 抗病基因擴(kuò)增曲線和溶解曲線

2.3.1 不同月齡紅河黃牛不同組織TLR2基因的表達(dá)量分析 由圖3 可知，TLR2基因在紅河黃牛心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有表達(dá)；12 月齡組TLR2基因的表達(dá)量依次為肝＞淋巴結(jié)＞腎＞背最長肌＞脾、肺＞心，36 月齡組TLR2基因的表達(dá)量依次為肝＞腎＞淋巴結(jié)＞脾＞心＞背最長?。痉?；60 月齡組TLR2基因的表達(dá)量依次為肝＞淋巴結(jié)＞脾＞心＞背最長?。灸I＞肺；TLR2基因在紅河黃牛肝組織表達(dá)量較高。不同月齡組的紅河黃牛TLR2基因在心、肝、脾、腎、背最長肌和淋巴結(jié)表達(dá)量均存在顯著差異，但肺組織表達(dá)量差異不顯著除外；TLR2基因表達(dá)量在60 月齡組為心、肝、脾、背最長肌和淋巴結(jié)最高，36 月齡組則為腎組織最高。

圖3 紅河黃牛TLR2 基因的mRNA 表達(dá)差異分析

2.3.2 不同月齡紅河黃牛不同組織TLR4基因的表達(dá)量分析 由圖4 可知，TLR4基因在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有表達(dá)；12 月齡組中TLR4基因的表達(dá)量依次為腎＞背最長?。酒ⅲ玖馨徒Y(jié)＞肺＞心＞肝，36 月齡組TLR4基因的表達(dá)量依次為肝＞心＞肺＞背最長?。灸I＞脾＞淋巴結(jié)；60 月齡組TLR4基因的表達(dá)量依次為肝＞心＞肺＞脾＞背最長?。玖馨徒Y(jié)＞腎；TLR4基因在紅河黃牛36 月齡和60 月齡組肝組織表達(dá)量較高，12 月齡組TLR4基因在腎組織表達(dá)量較高。不同月齡組的紅河黃牛TLR4基因表達(dá)量在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有顯著差異，且表達(dá)量均為36 月齡組最高，心、肝和肺組織表達(dá)量12 月齡組最低，脾、腎、背最長肌和淋巴結(jié)表達(dá)量60 月齡組最低。

圖4 紅河黃牛TLR4 基因的mRNA 表達(dá)差異分析

2.3.3 不同月齡紅河黃牛不同組織SLC11A1基因的表達(dá)量分析 由圖5 可知，SLC11A1基因在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有表達(dá)；12 月齡組SLC11A1基因的表達(dá)量依次為肺＞淋巴結(jié)＞肝＞脾＞腎＞肝＞心＞背最長肌，36 月齡組SLC11A1基因的表達(dá)量依次為脾＞淋巴結(jié)＞心＞肝＞背最長肌＞肺＞腎；60 月齡組SLC11A1基因的表達(dá)量依次為肺＞背最長?。酒ⅲ灸I＞肝＞淋巴結(jié)＞心。不同月齡組的紅河黃牛SLC11A1基因表達(dá)量在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有顯著差異，心、肝、脾和淋巴結(jié)表達(dá)量36 月齡組最高，肺、腎和背最長肌組織表達(dá)量60 月齡組最高，肺和腎組織表達(dá)量36 月齡組最低，脾和背最長肌組織表達(dá)量12 月齡組最低，心、肝和淋巴結(jié)表達(dá)量60 月齡組最低。

圖5 紅河黃牛SLC11A1 基因的mRNA 表達(dá)差異分析

2.3.4 不同月齡紅河黃牛不同組織DRB3基因的表達(dá)量分析 由圖6 可知，DRB3基因在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有表達(dá)；12 月齡組DRB3基因的表達(dá)量依次為腎＞肺＞淋巴結(jié)＞肝＞背最長肌＞脾＞心，36 月齡組DRB3基因的表達(dá)量依次為淋巴結(jié)＞肺＞背最長肌＞肝＞脾＞腎＞心；60 月齡組DRB3基因的表達(dá)量依次為淋巴結(jié)＞背最長?。灸I＞肝＞肺＞脾＞心；紅河黃牛DRB3基因較高表達(dá)量出現(xiàn)在36 月齡和60 月齡組。不同月齡組的紅河黃牛DRB3基因在心、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)表達(dá)量均存在顯著差異，但肝組織表達(dá)量差異不顯著除外；12 月齡和36 月齡組心、肝、脾和肺組織表達(dá)量差異不顯著，36 月齡和60 月齡腎、背最長肌和淋巴結(jié)表達(dá)量差異也不顯著。

圖6 紅河黃牛DRB3 基因的mRNA 表達(dá)差異分析

2.3.5 不同月齡紅河黃牛不同組織BoIFN-α基因的表達(dá)量分析 由圖7 可知，BoIFN-α基因在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)均有表達(dá)；12 月齡組中BoIFN-α基因的表達(dá)量依次為背最長?。灸I＞心＞淋巴結(jié)＞肝＞脾＞肺，36 月齡組BoIFN-α基因的表達(dá)量依次為肝＞心＞淋巴結(jié)＞背最長?。灸I＞肺＞脾；60 月齡組BoIFN-α基因的表達(dá)量依次為肝＞肺＞淋巴結(jié)＞心＞腎＞背最長?。酒?。不同月齡組的紅河黃牛BoIFN-α基因在心、肝、脾、肺、背最長肌和淋巴結(jié)表達(dá)量均存在顯著差異，但腎組織表達(dá)量差異不顯著除外；12 月齡腎和背最長肌組織表達(dá)量最高，36 月齡組心和脾表達(dá)量最高，60 月齡組肝、肺和淋巴結(jié)表達(dá)量最高。

圖7 紅河黃牛BoIFN-α 基因的mRNA 表達(dá)差異分析

2.3.6 不同月齡紅河黃牛不同組織BoIFN-γ基因的表達(dá)量分析 由圖8 可知，BoIFN-γ基因在心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、淋巴結(jié)均有表達(dá)；12 月齡組BoIFN-γ基因的表達(dá)量依次為心＞淋巴結(jié)＞肝＞脾＞背最長肌＞腎＞肺，36 月齡組BoIFN-γ基因的表達(dá)量依次為淋巴結(jié)＞腎＞脾＞肝＞心＞背最長?。痉危?0 月齡組BoIFN-γ基因的表達(dá)量依次為腎＞淋巴結(jié)＞背最長?。痉危靖危酒ⅲ拘?。不同月齡組的紅河黃牛BoIFN-γ基因在心、脾、肺、腎、背最長肌和淋巴結(jié)表達(dá)量均存在顯著差異，但肝組織表達(dá)量差異不顯著除外；36 月齡組心、肝、脾和淋巴結(jié)表達(dá)量最高，60 月齡組肺、腎和背最長肌組織表達(dá)量最高。

圖8 紅河黃牛BoIFN-γ 基因的mRNA 表達(dá)差異分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)測定的紅河黃牛SLC11A1、TLR2、TLR4、BoIFN-γ、BoIFN-α和BoLA-DRB36 種抗 病候選基因在不同月齡及各組織中表達(dá)量存在差異。研究中國荷斯坦牛TLR4基因的遺傳多態(tài)性及其與體細(xì)胞評分的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)牛TLR4基因的外顯子C1760T 突變中的CC基因型可作為奶牛乳房炎抗性篩選中的分子標(biāo)記[12]。牛TLR2可通過NF-Kb 途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β的產(chǎn)生[13]。TLR2幾乎在所有組織中表達(dá)，活性在TLRs 家族中最高，并且在脾臟中有高表達(dá)現(xiàn)象[14]，而本實(shí)驗(yàn)最高表達(dá)量卻出現(xiàn)在肝臟中。Tirumurugaan 等[15]研究山羊TLR2和TLR4在組織中表達(dá)發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4在淋巴結(jié)上有很高的表達(dá)量。林寶山[16]研究牦牛TLR2和TLR4基因發(fā)現(xiàn)，TLR2基因在小腸組織中表達(dá)量最高，其次是在腎、肺、肝、心、脾等組織表達(dá)，TLR4基因在乳腺表達(dá)量最高，其次是在脾、肝、小腸、腎等組織依次有較高水平的表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示TLR2在不同月齡紅河黃牛肝組織表達(dá)量最高，TLR4在36月齡和60 月齡肝組織上表達(dá)量較高，這可能是品種差異所引起。

SLC11A1最初在小鼠身上發(fā)現(xiàn)，在動物先天免疫中起到重要調(diào)節(jié)作用，并被認(rèn)為會影響疾病抵抗力。Liu 等[17]對中國荷斯坦牛SLC11A1基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究，相關(guān)分析表明SLC11A1基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性或耐藥有顯著的相關(guān)性。在水牛個體中，Capparelli 等[18]發(fā)現(xiàn)水牛SLC11A1基因3'UTR 位點(diǎn)的多態(tài)性和布魯氏菌易感性有關(guān)，并揭示出抗性型水牛中巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞SLC11A1的表達(dá)量顯著高于易感型水牛。Ganguly 等[19]證實(shí)水牛SLC11A1基因3'UTR 區(qū)GT 重復(fù)多態(tài)與結(jié)核桿菌的抗性有關(guān)。紅河黃牛SLC11A1基因在36 月齡組免疫組織中表達(dá)量較高，在其他2 組肺組織表達(dá)量較高。SLC11A1基因在肺組織有較高的表達(dá)量，可能與SLC11A1基因在肺組織中對結(jié)核桿菌抗性和易感性作用有關(guān)。有研究表明，SLC11A1基因多態(tài)變異和結(jié)核桿菌發(fā)病率顯著相關(guān)[19]。推斷其SLC11A1基因在紅河黃牛中對結(jié)核病抗性可能起到一定作用。

BoLA是牛MHC 的簡稱，主要有DR 和DQ 2 個區(qū)，其中DR 亞區(qū)包括DRA、DRB1、DRB2和DRB34 個基因座，DRA和DRB3是可高度表達(dá)的基因座[20]。Sharif 等[21]研究了BoLA-DRB3和疾病、SCS 的關(guān)系，表明荷斯坦牛中，BoLA-DRB3.2*23 和乳房炎的高發(fā)病率顯著相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BoLA-DRB3基因表達(dá)量在紅河黃牛36 月齡組和60 月齡組淋巴結(jié)組織表達(dá)量最高，而在其他組織中表達(dá)量相對較低；紅河黃牛DRB3基因在免疫組織表達(dá)量最高，與黃蘭[22]對DRB3基因在黔北麻羊免疫器官表達(dá)量的研究結(jié)果類似。而在紅河黃牛淋巴結(jié)組織BoLA-DRB3表達(dá)量也隨月齡逐漸增加。

干擾素（Interferon，IFN）是一類能夠誘導(dǎo)動物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，具有抑制病毒增殖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的生物學(xué)功能[23]。IFN分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，IFN-α來自白細(xì)胞，IFN-β來自纖維母細(xì)胞，它們具有相關(guān)的結(jié)構(gòu)并識別同一類受體，屬于Ⅰ型IFN；而Ⅱ型IFN 僅有IFN-γ，又稱免疫干擾素，不與Ⅰ型干擾素享用同一類受體[24-25]。IFN-α干擾素在動物體內(nèi)起著“衛(wèi)道士”的作用，在所有干擾素家族中發(fā)揮著較高的廣譜抗病毒活性[26]。紅河黃牛BoIFN-α基因在36 月齡組和60 月齡組肝組織表達(dá)量較高，在肝、肺、淋巴結(jié)組織中表達(dá)量隨月齡增加而增加，腎、背最長肌組織中表達(dá)量隨月齡增加而逐漸降低。IFN-γ在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、增加巨噬細(xì)胞殺菌力、影響細(xì)胞的增殖與凋亡等方面具有重要的研究意義，其主要是通過刺激或抑制相應(yīng)的基因表達(dá)發(fā)揮作用。IFN基因有3 個類型，分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中Ⅱ型中只有IFN-γ[27]。紅河黃牛BoIFN-γ基因在36 月齡組淋巴結(jié)中表達(dá)量最高，在腎和背最長肌中BoIFN-γ表達(dá)量隨月齡增加。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6 種抗病候選基因存在月齡及各組織的表達(dá)差異，這些差異理論上由基因多態(tài)性、mRNA 半衰期、啟動子活性、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平等多因素決定，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的細(xì)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

SLC11A1、TLR2、TLR4、BoIFN-γ、BoIFN-α和MHC-DRB3在紅河黃牛不同月齡或組織中表達(dá)量存在差異，且在不同組織中最高表達(dá)量出現(xiàn)在36～60 月齡組。