楊 速，操勇清，顧麗紅，李 麗，曾 濤，沈軍達(dá)，田 勇，李國勤，陶爭榮，陳 黎，毛長國，盧立志*

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；4.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?571100；5.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；6.余姚科邦番鴨育種有限公司，浙江寧波 315400）

番鴨（Cairina moschata），又名瘤頭鴨、麝香鴨，隸屬于雁形目（Anseriformes），鴨科（Anatidae）棲鴨屬（Cairina），起源于中、南美洲的熱帶地區(qū)[1]，已有超過300 年的飼養(yǎng)歷史[2]。與一般家鴨相比，番鴨體型較大，生長速度快，耐粗飼，產(chǎn)肉性能好[3]，同時肉質(zhì)鮮美，肌肉脂肪含量低且富含不飽和脂肪酸、維生素、鉀、鐵等，胸肉豐富且低卡路里，產(chǎn)肝性能好，諸多優(yōu)點(diǎn)使其成為禽肉中的上品和重要的肉類來源[4]。

微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite Marker），亦稱簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats,SSR），由核心序列和保守序列組成，具有諸多優(yōu)點(diǎn)：位點(diǎn)多、分布廣、多態(tài)性豐富等[5-6]。在動物遺傳育種中，微衛(wèi)星可用于遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析[7-8]、品種品系鑒定[9]、標(biāo)記輔助選擇[10]等。張燕等[11]采用微衛(wèi)星引物對福建省4 個番鴨品系進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，3 個微衛(wèi)星基因座共檢測到8 個等位基因，表現(xiàn)出中度遺傳多樣性；吳艷[12]的研究表明，番鴨與其他家鴨品種間的遺傳距離較大，與黃種彬等[13]的研究結(jié)果相似。目前，對番鴨遺傳多樣性的研究大多只涉及國內(nèi)番鴨品種（品系），而綜合國內(nèi)外番鴨品種（品系）的遺傳多樣性研究鮮有報道。本研究采用24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)對國內(nèi)外7 個番鴨群體進(jìn)行遺傳多樣性和群體聚類分析，為探索番鴨遺傳多樣性、明確遺傳背景、品種改良及種質(zhì)資源評估和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物來自福建省、浙江省寧波市余姚縣、浙江省溫州市、法國巴巴里和海南省瓊海市嘉積鎮(zhèn)，共7 個番鴨群體，樣本信息詳見表1。除法國巴巴里番鴨樣本全為母鴨外，其他群體公母鴨為1:1。

表1 7 個番鴨群體的樣本信息

1.2 血液采集及DNA 提取 對實驗番鴨進(jìn)行翅靜脈采血，用2 mL 含乙二胺四乙酸（EDTA）醫(yī)用真空采血管對血樣進(jìn)行抗凝封裝，置于-20℃保存。使用TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit（大連）提取血液基因組DNA。用NanoDrop ND-1000 濃度測定儀測定其濃度及純度（參照儀器說明書），將達(dá)標(biāo)樣本（OD260/OD280=1.8～2.0）稀釋至50 ng/μL，置于4℃保存，用于后續(xù)分型。

1.3 引物設(shè)計及PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 和相關(guān)參考文獻(xiàn)提供的鴨參考序列進(jìn)行篩選，選擇核心重復(fù)序列較多且在鴨品種中多態(tài)性相對較豐富的位點(diǎn)，共選取24 對引物，具體信息見表2。引物交由上海杰瑞生物工程有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為15 μL，具體為：DNA1 μL，2×PCRmix 7.5 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.15 μL，ddH2O 補(bǔ)至15 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變 性20 s，58 ℃退火20 s，72℃延伸40 s，共35 個循環(huán)，72℃修復(fù)延伸5 min，4℃保存。含熒光標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物用ABI-3730XL DNA Analyzer 全自動測序儀檢測。上樣總體積為10 μL，其中包括已經(jīng)混有ROX500 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參的上樣液Hi-Di Form amide（高質(zhì)量的去離子甲酞胺）9 μL，PCR 產(chǎn)物1 μL。

表2 24 對微衛(wèi)星引物信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用POPGENE1.32 軟件統(tǒng)計等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、基因流（Nm）、Shannon 信息指數(shù)（I）、F-統(tǒng)計量（Fis、Fit、Fst）以及群體遺傳距離相關(guān)參數(shù)。LittlePrograme 進(jìn)行多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content,PIC）的計算。利用MEGA5.0 軟件基于Nei’s 遺傳距離構(gòu)建UPGMA 遺傳進(jìn)化樹。利用GENAlEX6.5 軟件基于群體遺傳距離進(jìn)行主坐標(biāo)分 析（Principal Coordinates Analysis,PCoA）。利 用STRUCTURE 2.3.4 軟件評估群體遺傳結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳參數(shù) 由表3 可知，24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)在7 個番鴨群體中共檢測到了320 個等位基因，80個有效等位基因，平均有效等位基因數(shù)為3.339 6，其中AY493314 位點(diǎn)最高，為12.942 7 個；觀察雜合度在0.007 8～0.730 5 之間，平均為0.488 2；期望雜合度在0.027 0～0.923 7 之間，平均為0.488 2；基因流在0.331 2～15.379 8之間，平均為2.418 1，表明7 個群體間高度的基因交流；Shannon 信息含量范圍為0.089 0～2.783 2，平均值為1.134 7；多態(tài)信息含量在0.026 8～0.917 6 之間，平均為0.456 1，其中高度多態(tài)位點(diǎn)10 個（PIC＞0.5），中度多態(tài)位點(diǎn)8 個（0.5＞PIC＞0.25），低度多態(tài)位點(diǎn)6 個（PIC＜0.25）。

表3 24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性

由FSTAT2.9.3 計算的群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis）、總?cè)后w近交系數(shù)（Fit）和群體間基因分化系數(shù)（Fst）顯示，F(xiàn)is 在-0.454 6～0.768 6 之間，平均為0.262 5；Fit 在-0.276 5～0.789 8 之間，平均為0.331 6；Fst 在0.016 0～0.430 2 之間，平均為0.093 7，其中高度遺傳分化位點(diǎn)1 個（0.25＞Fst＞0.15），中度分化位點(diǎn)15 個（0.15＞Fst＞0.05），低度分化位點(diǎn)8 個（0.05＞Fst＞0）。

2.2 群體的遺傳多樣性 各番鴨群體的有效等位基因數(shù)在2.423 1～3.189 2 之間，平均為2.709 8，其中福建花羽番鴨含量最多，海南嘉積鴨含量最少；7 個番鴨群體中的期望雜合度平均為0.437 3，其中福建花羽番鴨最高為0.512 3，海南嘉積鴨最低為0.383 9。7 個番鴨群體中的多態(tài)信息含量均在0.25～0.5 之間，呈現(xiàn)中度多態(tài)，其中福建花羽番鴨最高為0.476 5，海南嘉積鴨最低為0.351 8。

2.3 群體間的遺傳距離和系統(tǒng)聚類分析 利用Popgene1.32軟件對7 個品種間的Nei’s 相似性和遺傳距離進(jìn)行了分析，同時根據(jù)遺傳距離，采用UPGMA 法進(jìn)行聚類，詳見表5 和圖2。7 個番鴨群體遺傳距離為0.020 9～0.164 1。其中，溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨遺傳距離最近（0.020 9）；福建花羽番鴨與法國巴巴里番鴨遺傳距離最遠(yuǎn)（0.164 1）。此外，福建花羽番鴨與其他6 個群體遺傳距離均較大，超過0.1。UPGMA 聚類圖結(jié)果顯示，7 個番鴨群體主要分為2 類，福建花羽番鴨與海南嘉積鴨聚為一類，其他5 個群體聚為一類，福建花羽番鴨與海南嘉積鴨聚為一類，余姚白羽番鴨和余姚花羽番鴨、溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨各自聚類后，再和福建白羽番鴨聚為一類。

表4 7 個番鴨群體的遺傳多樣性

表5 7 個番鴨群體間的Nei’s 遺傳距離

如圖2 所示，7 個番鴨群體主要分為2 支，福建花羽番鴨與海南嘉積鴨聚為一支，其他5 個群體聚為一支，福建花羽番鴨與海南嘉積鴨聚為一支，余姚白羽番鴨和余姚花羽番鴨、溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨各自聚類后，再和福建白羽番鴨聚為一支。

圖2 7 個番鴨群體的Nei’s 遺傳距離UPGMA 聚類圖

2.4 主坐標(biāo)分析 主坐標(biāo)分析可將數(shù)據(jù)的差異性或相似性可視化。采用GenAlEX6.5 軟件建立二維位置圖，對7 個番鴨群體進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果見圖3。如圖3 所示，第一、第二主坐標(biāo)分別解釋了總變異的45.42%、24.32%，與UPGMA 聚類圖分析結(jié)果相似，余姚花羽番鴨、余姚白羽番鴨、溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨之間遺傳變異較小，而福建白羽番鴨、福建花羽番鴨和海南嘉積鴨與其他群體間存在一定的遺傳距離。

圖3 7 個番鴨群體PCoA 分析

2.5 Structure 貝葉斯聚類分析 采用STRUCTURE2.3.4對7 個番鴨群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，建系方法與評判標(biāo)準(zhǔn)參照Pritchard[14]與Evanno[15]。如圖4 所示，隨著假設(shè)亞群數(shù)目K 的增加，LnP(D)逐漸增加，而變化率逐漸減小，在K=2～3 時變化幅度最大。當(dāng)K=3 時，LnP(D)的衍生值ΔK 取到最大值（94.917 4），此外，當(dāng)K=7 時，ΔK 出現(xiàn)拐點(diǎn)，在一定范圍內(nèi)取到極大值。結(jié)合LnP(D) 的變化趨勢和ΔK 的取值，最終確定以K=3 為反映供試群體真實情況的最佳取值，即7 個番鴨群體被分為3 個類群，如圖5 所示。如圖5 所示，福建白羽番鴨和福建花羽番鴨為一個類群，余姚花羽番鴨、余姚白羽番鴨、溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨為一個類群，海南嘉積鴨為一個類群。各群體間存在不同程度基因滲透現(xiàn)象。

圖4 K 值與ΔK 的關(guān)系

圖5 7 個番鴨群體貝葉斯SRUCTURE 聚類圖（K=3 或7）

3 討論

3.1 24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)及7 個番鴨群體的遺傳多樣性 遺傳多樣性是指種內(nèi)不同群體或者種群內(nèi)不同個體間的遺傳變異總和，可體現(xiàn)在種群、個體和分子等多個水平上。在遺傳學(xué)上，一般用遺傳參數(shù)來度量遺傳變異的程度，觀察雜合度、期望雜合度、Shannon 信息含量和多態(tài)信息含量等均能反映群體或多態(tài)位點(diǎn)的遺傳多樣性，其值越高表明遺傳多樣性越高，該群體或位點(diǎn)所攜帶的遺傳信息越豐富[16]。有效等位基因反映了在遺傳過程中起作用的等位基因數(shù)，其值越大，遺傳結(jié)構(gòu)的整齊度越低，群體多樣性越高[17]。位點(diǎn)多樣性是指基于某種分子標(biāo)記技術(shù)測得的所有受試群體的遺傳變異。Wu 等[18]在6個鴨群體（包含1 個番鴨種群）中檢測到20 個微衛(wèi)星位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在番鴨上的平均有效等位基因、雜合度和多態(tài)信息含量分別為5.735 1、0.807 9 和0.758 3，具有較高的遺傳多樣性。本研究在7 個番鴨群體中檢測到24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)，平均等位基因數(shù)、有效等位基因、觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為13.333 3、3.339 6、0.325 8、0.488 2 和0.456 1，均高于Khanahmadi 等[19]在番鴨群體中的檢測結(jié)果，但低于Wu 等[18]的檢測結(jié)果。王統(tǒng)苗等[20]在6 個鴨品種中檢測到16 個微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中平均等位基因數(shù)、有效等位基因低于本研究結(jié)果，而觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量高于本研究。微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性直接由供試群體的遺傳差異所決定，即相同的微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同組成的群里遺傳多樣性不同，因此，同一個微衛(wèi)星位點(diǎn)在遺傳距離較遠(yuǎn)的群里可能表現(xiàn)截然不同的結(jié)果[21-22]。本研究24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)中，10 個位點(diǎn)為高度多態(tài)信息位點(diǎn)，同時其等位基因數(shù)、有效等位基因、觀察雜合度和期望雜合度也處于較高水平，說明這些位點(diǎn)包含了較為豐富的遺傳信息，在今后番鴨的遺傳學(xué)分析和遺傳育種實踐中具有較高的參考價值。此外，本研究24 個位點(diǎn)平均多態(tài)位點(diǎn)信息含量為0.456 1，能較好地詮釋番鴨的遺傳結(jié)構(gòu)。

不同于位點(diǎn)多樣性，群體多樣性是指一個群體內(nèi)所有個體遺傳變異的總和，而分子標(biāo)記是作為檢測群體多樣性的方法[23]。自然選擇、基因突變、遺傳遷移、基因交流和遺傳漂變等共同作用造成群體間的遺傳差異，隨著遺傳差異的不斷累積，形成了豐富的遺傳多樣性。遺傳多樣性有2 個方面含義，即變異水平的高低和變異的分布格局[24]。遺傳多樣性是保證群體在不同環(huán)境下獲得適應(yīng)性的基礎(chǔ)，是生命進(jìn)化并保持活力的根本[25]。本研究中，福建花羽番鴨6 個遺傳參數(shù)均最高，不僅高于其他地區(qū)番鴨群體，也高于福建白羽番鴨，表明福建花羽番鴨具有較高的遺傳多樣性，原因可能是福建花羽番鴨為雜交品系。福建白羽番鴨除有效等位基因低于余姚花羽番鴨，其他指標(biāo)僅次于福建花羽番鴨，高于其他5 個群體。本研究中，與其他地區(qū)相比，福建省番鴨具有較高的遺傳多樣性，原因可能與福建省引種較早以及復(fù)雜多樣的地理和生態(tài)環(huán)境有關(guān)[13]?？铝馵26]采用微衛(wèi)星對福建省番鴨進(jìn)行遺傳多樣性分析，多態(tài)信息含量顯示為中度多態(tài)，與本研究結(jié)果相似，雷祖建[26]的研究結(jié)果顯示，福建省番鴨的多態(tài)信息含量為0.567 2，為高度多態(tài)。造成差異的原因可能是選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)的不同或者受試群體所處環(huán)境的不同。本研究7 個群體中，海南嘉積鴨的有效等位基因、期望雜合度、Shannon 信息含量和多態(tài)信息含量4 個指標(biāo)最低，表明海南嘉積鴨遺傳多樣性較低。原因可能是海南嘉積與內(nèi)陸群體基因交流少，閉鎖繁育程度高，又或是海南嘉積鴨選育程度較高，群體純合位點(diǎn)增多，雜合位點(diǎn)降低，導(dǎo)致遺傳多樣性下降。從保護(hù)地方品種遺傳資源的角度，應(yīng)引起重視?？傮w而言，本研究7 個番鴨群體遺傳多樣性較為豐富，平均多態(tài)信息含量為中度多態(tài)，但未檢測到高度多態(tài)信息含量的群體，因此番鴨遺傳多樣性的保護(hù)不容忽視。隨著育種技術(shù)的不斷發(fā)展，畜禽育種的速度和程度正在不斷提高，人們能在更短的周期內(nèi)獲得更多更優(yōu)質(zhì)的畜禽產(chǎn)品，而忽略了保護(hù)遺傳資源的多樣性，畜禽遺傳資源是不可再生的社會寶貴資源，是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要前提。因此，可采取建立保種場、適當(dāng)進(jìn)行基因交流、減少近交等措施提高畜禽群體的遺傳多樣性，增加畜禽群體對環(huán)境的適應(yīng)力和進(jìn)化潛力。

3.2 7 個番鴨群體的遺傳距離及其聚類 F-統(tǒng)計量中的Fis 可以度量群體中近親的交配程度，F(xiàn)is 為正表示雜合子缺失，發(fā)生了近親交配，F(xiàn)is 為負(fù)表示雜合子過剩，發(fā)生了近親交配。在7 個番鴨檢測到的24 個位點(diǎn)中AJ272581 和AY493282 表現(xiàn)為雜合子過剩，其他位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子缺失，表明群體內(nèi)親近交配比例較高。同時雜合子的缺失可能表示該位點(diǎn)受到人工選擇的影響，即個體間交配的機(jī)會受到人為干擾[27]。Fst 反映群體間遺傳分化程度，其值越大表明分化越明顯，研究表明Fst 的值分布在0～0.05、0.05～0.15、0.15～0.25 和大于0.25 分別對應(yīng)群體分化較弱、群體中等分化、群體分化較大和群體極大分化。本研究7 個番鴨群體的Fst均值為0.093 7，表明群體間為中度分化，說明7 個群體間在一定程度上已經(jīng)形成了各自的遺傳特性?；蛄魇侵富驈囊粋€個體到另一個個體之間的轉(zhuǎn)移，它可以防止物種適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件或通過新基因的傳遞促使物種進(jìn)化[28]。研究表明，當(dāng)Nm 大于1，群體間基因流作用強(qiáng)，能有效抑制分化，當(dāng)Nm 小于1 時，促使群體分化[29]。本研究24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)Nm 均值為2.418 1，僅有1 個位點(diǎn)基因流小于1，表明基因流在7 個群體中作用較強(qiáng)，抑制群體的分化。

遺傳距離是研究物種多樣性的基礎(chǔ)，它可以反映群體間基因差異程度。吳艷[12]對幾個鴨群體遺傳距離及聚類的研究結(jié)果顯示，番鴨與北京鴨、櫻桃谷鴨、奧白星鴨和紹興鴨遺傳距離較遠(yuǎn)，且在UPGMA 聚類圖中單獨(dú)聚為一類。因為番鴨為棲鴨屬，其生物學(xué)特性與河鴨屬的家鴨有很大區(qū)別。本研究中，福建花羽番鴨與其他群體均存在較遠(yuǎn)的遺傳距離，而遺傳參數(shù)分析表明福建花羽番鴨的遺傳多樣性最高，說明福建花羽番鴨攜帶較多獨(dú)特的遺傳信息。海南嘉積鴨與其他群體的平均遺傳距離為0.118 8，僅次于福建花羽番鴨，原因可能是海南嘉積鴨從國外引進(jìn)后長期適應(yīng)海南獨(dú)特的地理環(huán)境，同時與內(nèi)陸番鴨缺乏基因交流。在UPGMA 聚類圖中，福建花羽番鴨和海南嘉積鴨聚為一支，在另一支中，福建白羽番鴨單獨(dú)聚為一支，余姚花羽番鴨、余姚白羽番鴨、溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨聚為一支，表明親緣關(guān)系較近。番鴨群體STRUCTURE 聚類分析顯示，7 個群體最佳分類K 值為3，即分為3 個類群，與UPGMA 聚類結(jié)果不同，STRUCTURE 聚類結(jié)果中，福建花羽番鴨與福建白羽番鴨聚為一類，福建花羽番鴨是由福建白羽番鴨和福建黑羽番鴨雜交形成的品種，二者具有較近的親緣關(guān)系，因此，本研究認(rèn)為STRUCTURE聚類結(jié)果更可靠。Nei’s 遺傳距離、UPGMA 聚類、主坐標(biāo)分析和STRUCTURE 聚類分析均表明，余姚花羽番鴨、余姚白羽番鴨、溫州麻步番鴨和法國巴巴里番鴨親緣關(guān)系較近，聚類分析均未顯示明顯的地理特異性。

4 結(jié)論

本研究利用24 個微衛(wèi)星位點(diǎn)對國內(nèi)外7 個番鴨群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。7 個番鴨群體遺傳多樣性表現(xiàn)為中度水平，其中福建花羽番鴨遺傳多樣性最高，海南嘉積鴨較低。群體間為中度分化，存在頻繁的基因交流，聚類分析均未顯示明顯的地理特異性。