樊慶燦，鄭路程，王倩倩，劉 犇,2，楊 雪，胡 威,2，鄭文亞

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西宜春 336000）

過去幾年中，快大型肉雞的胸肌中白條紋肉（White Striping，WS）和木質(zhì)肉（Woody Breast，WB）異常表型不斷上升。WS 存在數(shù)量不等的與肌纖維平行的白色條紋[1]。WB 呈木質(zhì)化，發(fā)病嚴(yán)重的肌肉表面可同時出現(xiàn)白色條紋和彌漫分布的脊?fàn)钔黄餥2]，嚴(yán)重影響雞肉的屠宰外觀和肉品質(zhì)。WS 和WB 表型有所不同，但肌肉組織均有所損傷。組織學(xué)評估表明，異常樣品均呈現(xiàn)肌肉表層的退化，包括纖維壞死和溶解、異常纖維化和脂質(zhì)增多[3]。為了闡明WS/WB 表型發(fā)展的分子機(jī)制，Zambonelli 等[4]比較了的Ross 708 肉雞WS/WB胸肌和正常胸肌基因表達(dá)模式，鑒定出的差異表達(dá)基因（DEG）與肌肉發(fā)育、炎癥、多糖代謝和鈣信號傳導(dǎo)有關(guān)。Malila 等[5]則篩選出鈣信號傳導(dǎo)和Ras 相關(guān)蛋白1信號傳導(dǎo)等8 個信號通路與WS/WB 的產(chǎn)生有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+等離子、氧化應(yīng)激和細(xì)胞程序性死亡引起WS/WB 表型。本研究利用GEO2R 軟件的相同標(biāo)準(zhǔn)分別分析2 組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，統(tǒng)計快大型肉雞正常肌肉表型和WS/WB 肌肉表型的差異表達(dá)基因，以進(jìn)行共同基因分析，并對篩選到的共同基因進(jìn)行功能注釋和功能富集分析，探討WS/WB 肌肉表型的發(fā)生機(jī)理，為雞屠宰和肉質(zhì)性狀的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)及樣本 本研究數(shù)據(jù)來自于美國國家生物信息數(shù)據(jù)庫中的GEO 數(shù)據(jù)庫，編號分別為GSE79276 和GSE107362，2 個數(shù)據(jù)系列的實驗動物分別為羅斯708和羅斯308 的公雞，屠宰日齡均為49 d，樣品均為胸大肌，樣品表達(dá)量檢測分別采用GPL21385 和GPL24307平臺。具體信息見表1。

1.2 軟件與方法 打開GEO 數(shù)據(jù)庫中的分析工具GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），輸入GSE 79276，按照表1 設(shè)定正常表型組（NM）和WS/WB 表型組（WS/WB），選擇Benjamini &Hochberg（False discovery rate）矯正，數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，進(jìn)行差異表達(dá)分析。下載差異分析結(jié)果、數(shù)據(jù)表達(dá)量圖和差異分析火山圖，將Padj＜0.05 且|log2FC|＞1 的轉(zhuǎn)錄本設(shè)為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（Differential Expression Transcriptions，DET）。根據(jù)GPL21385 平臺信息，查找DET 對應(yīng)的基因，設(shè)為差異表達(dá)基因（Differential Expression Gene，DEG）。刪除無基因信息的DETs。在DAVID V6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中進(jìn)行官方基因名轉(zhuǎn)換。GSE107362 數(shù)據(jù)分析步驟如上。將GSE79276 和GSE107362 中的DEGs 輸入到Bioinformatics &Evolut ionary Genomics（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中繪制韋恩圖，下載共同差異表達(dá)基因（Identical Differential Expression Gene，IDEG）。利用David v6.8 進(jìn)行IDEGs 的信號通路分析。將IDEGs 導(dǎo)入到String（https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=NPdugdyy2MoP&input_page_show_search=on）中進(jìn)行互作分析，并下載蛋白互作文件，導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2 中繪制互作圖，cytoHubba 插件MHC 算法計算核心基因，BINGO 插件進(jìn)行生物過程的富集分析。

表1 數(shù)據(jù)及樣本信息統(tǒng)計表

2 結(jié)果

2.1 2 個數(shù)據(jù)系篩選到的DEGs 2 個數(shù)據(jù)系的DETs 結(jié)果見圖1。Log2FC＜0 表示W(wǎng)S/WB 胸肌中基因表達(dá)量下調(diào)。表2 中為2 個數(shù)據(jù)系的差異DEGs。GSE79276數(shù)據(jù)系共篩選出104 個DEGs（Padj＜0.05），其中17個上調(diào)，87 個下調(diào)。下調(diào)基因白介素3 調(diào)節(jié)核因子基因（Nuclear Factor,Interleukin 3 Regulated，NFIL3）是P值最小的基因，下調(diào)基因半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白質(zhì)3 基因（Cysteine and Glycine-Rich Protein 3，CSRP3）是差異倍數(shù)最大的基因。GSE107362 數(shù)據(jù)系共 篩 選 出953 個DEGs（Padj＜0.05），其中179 個 上調(diào)，774 個下調(diào)。上調(diào)基因細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子1（Suppressor Of Cytokine Signaling 1，SOCS1）是P值最小的基因，上調(diào)基因B 細(xì)胞表面抗原CD40（CD40 Molecule，CD40）基因是差異倍數(shù)最大的基因。

表2 2 個數(shù)據(jù)系差異基因統(tǒng)計表

圖1 2 個數(shù)據(jù)系差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本火山圖

2.2 2 個數(shù)據(jù)系篩選到的IDEGs 2 個數(shù)據(jù)系IDEG 分析見圖2。2 組DEGs 共篩選出23 個IDEGs，且所有基因均下調(diào)，基因相關(guān)信息見表3。NFIL3和CSRP3分別為GSE79276 數(shù)據(jù)系差異分析的P值最小和差異倍數(shù)最大的基因。這些基因中，纖連蛋白1（Fibronectin，F(xiàn)N1）、VI 型膠原蛋白α3 鏈編碼基因（Collagen Type VI Alpha 3 Chain，COL6A3）和血小板反應(yīng)蛋白1 基因（Thrombospondin 1，THBS1）為篩選到的核心基因，3 個基因間存在互作關(guān)系（圖3）。

表3 2 個數(shù)據(jù)系的IDEGs 統(tǒng)計信息

圖3 部分有互作關(guān)系的IDEGs

2.3 IDEGs 的聚類和信號通路分析 23 個IDEGs 的聚類分析結(jié)果見圖4a。GO 分析共篩選出6 條“P＜0.05”的條目，其中生物黏附（Biological Adhesion）和細(xì)胞黏附（Cell Adhesion）是P值最小的條目，參與2個條目的基因均為FN1、COL6A3、THBS1和血小板反應(yīng)蛋白2（Thrombospondin 2，THBS2）。剩余的4 個條目中，3 個條目為信號傳導(dǎo)相關(guān)條目，最后一個為生物調(diào)節(jié)條目。23 個IDEGs 的信號通路分析結(jié)果見圖4b。信號通路分析共篩選出3 個“P＜0.05”的信號通路，其中細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路（ECM-receptor interaction）是P值最小的信號通路，其次為黏附斑信號通路（Focal Adhesion），參與2 個信號通路的基因均為軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（Cartilage Oligomeric Matrix Protein，COMP），I 型膠原蛋白α3 鏈編碼基因（Collagen Type VI Alpha 2 Chain，COL1A2）、FN1、COL6A3、THBS2和THBS1。最后一個通路為吞噬體信號（Phagosome）通路，參與該通路的基因為COMP、THBS2、THBS1基因。

圖4 IDEGs 的GO 分析和信號通路分析結(jié)果

3 討論

3.1 差異表達(dá)分析方法 本文使用GEO2R 軟件進(jìn)行分析，與Zambonelli 等[4]和Malila 等[5]分析方法有所差異。生物信息學(xué)盡管有多種方法，但并沒有公認(rèn)的最準(zhǔn)確的方法，只是從不同角度盡量挖掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的更多信息，以便進(jìn)行后續(xù)的功能富集分析。利用GEO2R 軟件同樣的標(biāo)準(zhǔn)和方法對2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，一方面利用GEO2R 挖掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的更多信息，另一方面盡量減少分析方法等對結(jié)果的影響，使篩選到的共同基因更為準(zhǔn)確可靠。

3.2 差異表達(dá)基因分析結(jié)果 本研究對2 個數(shù)據(jù)系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)WS/WB 表型與正常表型胸肌肉相比，下調(diào)的DEGs 的數(shù)目均遠(yuǎn)大于上調(diào)基因的數(shù)目，說明在WS/WB 表型雞中，胸肌部分正常基因的表達(dá)降低。韋恩圖分析篩選到的基因均為下調(diào)，也進(jìn)一步證明了上述內(nèi)容，即營養(yǎng)、氧化應(yīng)激和缺氧等因素導(dǎo)致快大型雞胸肌中正常的基因表達(dá)受到抑制[6]，從而導(dǎo)致雞胸肌不能維持正常的生理狀態(tài)和功能，出現(xiàn)肌纖維壞死和脂質(zhì)增多等表型。

3.3 IDEGs 的聚類分析 IDEGs 的GO 聚類分析結(jié)果中，篩選出細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)相關(guān)的5 個條目。信號通路分析中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)受體互作和黏附斑信號通路，二者結(jié)果一致。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）由結(jié)構(gòu)和功能大分子的復(fù)雜混合物組成，細(xì)胞和ECM 之間的特異性相互作用是由跨膜分子整合素介導(dǎo)的[7]。黏附斑信號通路是一種依賴于黏附斑激酶（Focal Adhesion Kinase 1，F(xiàn)AK）的信號通路，該通路利用整合素介導(dǎo)ECM 和細(xì)胞之間的黏附作用，并刺激幾種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的活性[8]。研究表明，黏附斑信號通路與成肌細(xì)胞分化、肌肉纖維形成和肌肉大小的發(fā)育狀態(tài)相關(guān)[9]，并可以通過整合素翻譯跨細(xì)胞質(zhì)膜傳遞的細(xì)胞骨架應(yīng)力和應(yīng)變信號，引起肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組[10]?；|(zhì)受體互作和黏附斑信號通路可能介導(dǎo)了胞外異常信號進(jìn)入胞內(nèi)，引入肌細(xì)胞的異常代謝。

3.4 IDEGs 功能分析 23 個IDEGs 中，COMP、FN1、COL1A2、COL6A3、THBS2、THBS1基因與細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)這些基因還可能參與了肌肉發(fā)育和調(diào)控。COMP 蛋白是一種在肌肉骨骼和心血管系統(tǒng)中都存在的細(xì)胞外基質(zhì)非膠原糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，COMP

可維持線粒體穩(wěn)態(tài)并控制平滑肌細(xì)胞的表型特征[11]。FN1纖連蛋白可以結(jié)合肌細(xì)胞和肌動蛋白表面，參與細(xì)胞運動和維持細(xì)胞形態(tài)[12]。COL1A2和COL6A3均編碼膠原蛋白多肽鏈。膠原蛋白家族成員是在肌肉發(fā)育中具有重要調(diào)控作用的ECM 蛋白。XIII 型膠原蛋白能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉接頭正確組裝[13]。XXV 膠原蛋白對于成肌細(xì)胞融合到肌纖維中是必需的[14]。血小板反應(yīng)蛋白（THBS）是參與多種生物學(xué)過程的基質(zhì)細(xì)胞蛋白。THBS 家族每個成員受組織生長、愈合和重塑等誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維中THBS 的表達(dá)可穩(wěn)定肌膜[15]。這些信號蛋白的下調(diào)可能會影響肌細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。

IDEGs 中，膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1，ANXA1）、CSRP3、肌球蛋白2（Myozenin 2，MYOZ2）、ATPase胞質(zhì)/ 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運2（ATPase Sarcoplasmic/Endop lasmic Reticulum Ca2+，ATP2A2）直接參與肌肉發(fā)育與功能的調(diào)節(jié)。ANXA1 蛋白參與和調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排[16]，并介導(dǎo)吞噬體和肌動蛋白細(xì)胞骨架之間的相互作用[17]。CSRP3 蛋白是肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)劑，用作肌源性bHLH（Basic Helix-Loop-Helix）轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合肌動蛋白絲，將肌動蛋白絲交聯(lián)成束，防止絲切蛋白介導(dǎo)的解聚反應(yīng)[18]。MYOZ2 是一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白，在肌原纖維形成中起重要作用，參與連接α-肌動蛋白，并將鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至肌小節(jié)，參與肌肉活動的調(diào)節(jié)[19]。ATP2A2基因編碼心肌肌網(wǎng)Ca2+-ATP 酶，它是位于骨骼肌的肌質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細(xì)胞內(nèi)泵。該酶催化ATP 的水解，并促進(jìn)鈣從胞質(zhì)向肌漿網(wǎng)腔的轉(zhuǎn)運，參與收縮/松弛周期的調(diào)節(jié)[20]。這4 個基因的下調(diào)，可能直接影響肌動蛋白的形態(tài)和正常功能，導(dǎo)致肌肉表型異常。

IDEGs 中，肌 醇5-磷 酸 酶2（Synaptojanin 2，SYNJ2）參與不同的膜運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞具有抑制作用[21-22]，可能會導(dǎo)致攜帶膽固醇的低密度脂蛋白（LDL）大量進(jìn)入細(xì)胞。載脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，APOA1）是血漿中高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分，HDL 具有抗氧化和保護(hù)LDL 的作用，并促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯等脂類外排[23]。ANXA1介導(dǎo)膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到多囊泡體（MVB）的轉(zhuǎn)運，并刺激MVB 分泌具有保護(hù)和運輸脂質(zhì)功能的外泌體[24]。推斷SYNJ2、APOA1、ANXA1表達(dá)量的下降可能引起膽固醇等脂質(zhì)在肌肉細(xì)胞的積累和破壞，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[25]，產(chǎn)生大量吞噬LDL 和氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）的巨噬細(xì)胞，最終形成泡沫細(xì)胞并破裂，在這個過程中將脂蛋白降解為各種脂質(zhì)[26]，這可能是發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤和脂質(zhì)沉積的因素之一。微管相關(guān)蛋白1B 基因（Microtubule Associated Protein 1B，MAP1B）編碼微管相關(guān)蛋白。該家族的蛋白質(zhì)被認(rèn)為與微管組裝有關(guān)，微管與其他纖維一起構(gòu)成細(xì)胞骨架，微管雙螺旋結(jié)構(gòu)支撐著細(xì)胞生理形態(tài)[27]。該基因表達(dá)量的下調(diào)可能引起肌肉細(xì)胞形態(tài)的變化。

綜上所述，WS/WB 表型的產(chǎn)生可能是由于各種因素導(dǎo)致肌肉組織接受到異常信號，經(jīng)整合素介導(dǎo)后，通過黏附斑信號通路引起胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的異常，最終導(dǎo)致胸肌細(xì)胞功能異常，肌肉纖維和肌動蛋白的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，引起異常表型。

4 結(jié)論

本研究利用GEO 數(shù)據(jù)的2 個數(shù)據(jù)系篩選WS/WB表型的差異表達(dá)基因，篩選到23 個共同表達(dá)基因，功能富集分析發(fā)現(xiàn)部分基因富集在信號傳導(dǎo)和細(xì)胞黏附通路，參與ECM 受體互作通路和黏附斑信號通路。此外，23 個IDEGs 中，ANXA1、CSRP3、MYOZ2和ATP2A2基因直接參與肌動蛋白結(jié)構(gòu)組成和功能調(diào)節(jié)，COMP和FN1等6 個基因通過調(diào)節(jié)肌肉組織信號傳導(dǎo)和細(xì)胞黏附活動，維持肌肉正常生理功能。