彭 聰，黎力之，張進(jìn)明，關(guān)瑋琨，廖曉鵬，黃 曉，張海波*，郭冬生*

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江西宜春 336000；2.江西省養(yǎng)蜂研究所，江西南昌 330000；3.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266000）

靈芝多糖（Ganoderma Lucidum Polysaccharide，GLP）是靈芝屬真菌的菌絲體和子實(shí)體的次生代謝產(chǎn)物，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等一種或多種單糖聚合而成[1-2]。GLP 通過改善胰島細(xì)胞功能，抑制機(jī)體胰島素抵抗，并清除體內(nèi)膽固醇、甘油三酯（Triglyceroles，TG）和游離脂肪酸等物質(zhì)，調(diào)節(jié)糖脂代謝[3]。GLP 促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，清除或抑制腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）-α、白介素（IL）-1β、IL-6 等促炎因子產(chǎn)生，提高非特異性免疫和吞噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]。GLP 在調(diào)節(jié)抗氧化功能方面存在重要作用[5]，動(dòng)物攝入GLP 后可上調(diào)核因子E2 相關(guān)因子2（NF-E2-related Factor 2，Nrf2），下調(diào)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated Protein-1，Keap1），介導(dǎo)Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（Antiox idant Response Element，ARE）信號(hào)通路，促進(jìn)血紅素氧合酶 1（Heme Oxygenase-1，HO-1）與醌氧化還原酶-1（NADPH：Quinone Oxidoreductase1，NQO1）生成，清除體內(nèi)過多自由基、活性氧，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能[6-8]。此外，GLP 可提高動(dòng)物體中谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase From Micrococcus Lysodeikticus，CAT）等活性，抑制脂質(zhì)過氧化，緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)[9-10]。目前較缺乏有關(guān)GLP 在動(dòng)物抗氧化作用中的系統(tǒng)綜述。因此，本文重點(diǎn)闡述GLP 調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE 通路增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性以及GLP 在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用，以期為畜牧生產(chǎn)提供理論參考。

1 GLP 概述

1.1 GLP 結(jié)構(gòu) GLP 是以β-（1,3）-糖苷鏈為主鏈，伴有β-（1,4）和β-（1,6）連接的多糖[11]。GLP 一級(jí)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性高度相關(guān)，單糖間以β-（1,3）-和β-（1,6）-或β-（1,4）-和β-（1,6）-糖苷鏈連接而成的GLP 功能活性最高，但僅以β-（1,4）進(jìn)行單糖鏈連接的多糖活性較低[12-14]。此外，GLP 的分子量大小、黏度、分支度、溶解度、化學(xué)基團(tuán)修飾等均影響GLP 抗氧化活性[15]。

1.2 GLP 生物學(xué)功能 在調(diào)節(jié)動(dòng)物糖脂代謝方面，糖尿病大鼠飼喂400 mg/（kg·d）GLP 14 d 后，顯著降低肝臟內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶蛋白和葡萄糖-6-磷酸酶表達(dá)量，血糖濃度降低[16]。200 μg/kg GLP 飼喂高脂模型小鼠28 d 后，血清TG、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇含量顯著增加，血脂降低[17]。利用150 mg/kg·d GLP 飼喂肝損傷小鼠10 d后，血清中TG、游離脂肪酸含量顯著低于對(duì)照組，減少肝臟脂質(zhì)沉積[18]。在免疫調(diào)節(jié)方面，GLP 提高動(dòng)物免疫細(xì)胞活性，減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，緩解炎癥反應(yīng)[19]。研究表明，在乳腺炎癥小鼠飼料中添加8% GLP，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等細(xì)胞炎性因子含量與髓過氧化物酶活性均顯著降低，減輕小鼠乳腺炎癥反應(yīng)[20]。此外，GLP 具有還原能力，阻止脂質(zhì)過氧化物形成[21]。利用200 mg/kg GLP 灌胃四氯化碳溶液誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠2 周后，小鼠肝臟丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量下降0.45 nmol/mg pro，說明GLP 能顯著降低機(jī)體內(nèi)MDA 含量，緩解脂質(zhì)過氧化[22]。在改善動(dòng)物腸道環(huán)境方面，GLP 通過增加腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量與腸絨毛高度，促進(jìn)黏蛋白分泌，改善腸道黏膜完整，保護(hù)腸黏膜屏障。日糧中添加100 mg/（kg·d）GLP 飼喂免疫抑制小鼠后發(fā)現(xiàn)，空腸絨毛高度和隱窩深度顯著增加，小腸消化吸收效率增強(qiáng)，免疫力提高，促進(jìn)機(jī)體健康[23]。研究發(fā)現(xiàn)，利用100 mg/（kg·d）黑靈芝多糖飼喂SPF級(jí)雌性小鼠，小鼠空腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量和平均每根絨毛黏液面積分別較模型組高50% 和75%，黏蛋白分泌增加，抑制潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生[24]。

2 GLP 抗氧化作用機(jī)制

2.1 GLP 介導(dǎo)Keap1-Nrf2/ARE 通路增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能Nrf2是Keap1-Nrf2/ARE 通路中關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)的Nrf2 蛋白是機(jī)體氧化應(yīng)激的感受器，通過與ARE 相互作用，調(diào)控多種抗氧化酶和II 相解毒酶基因表達(dá)，增加HO-1、NQO1、SOD 等含量，清除過量自由基和脂質(zhì)過氧化物，提高機(jī)體抗氧化功能。GLP 進(jìn)入細(xì)胞后能上調(diào)Nrf2基因表達(dá)，下調(diào)Keap1基因表達(dá)，Nrf2 與Keap1 蛋白解偶聯(lián)，釋放Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核[6]。Nrf2 與核內(nèi)Maf 蛋白形成異源二聚體后與ARE 結(jié)合，激活HO-1、SOD和NQO1基因表達(dá)，在細(xì)胞防御系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色[25]。Lee 等[26]研究GLP 對(duì)過氧化氫（Hydrogen Peroxide，H2O2）誘導(dǎo)小鼠成肌細(xì)胞損傷修復(fù)中發(fā)現(xiàn)，在處于1 mmol/L H2O2中的成肌細(xì)胞中添加50 μg/mL GLP，細(xì)胞核中Nrf2 含量顯著增加，體系中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）含量顯著降低，細(xì)胞存活率提高至81.7%，且Nrf2基因表達(dá)程度與GLP 處理時(shí)間和濃度呈正比。綜上表明，GLP 能促進(jìn)Nrf2 蛋白生成，激活Nrf2/ARE 通路，提高動(dòng)物抗氧化功能。

HO-1與NQO1是Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路的下游基因，HO-1 蛋白可以清除過量自由基、過氧化物和過氧亞硝酸鹽，緩解氧化應(yīng)激；NQO1 可以催化醌還原成氫醌并抑制ROS 產(chǎn)生，防止DNA 氧化損傷[27]。GLP 可通過激活Nrf2，上調(diào)機(jī)體中HO-1與NQO1基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抗氧化功能調(diào)控[10]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠成肌細(xì)胞Nrf2基因后，HO-1基因表達(dá)下降，說明Nrf2 對(duì)HO-1基因表達(dá)具有促進(jìn)作用[26]；在H2O2誘導(dǎo)小鼠成肌細(xì)胞損傷試驗(yàn)中添加GLP 發(fā)現(xiàn)，Nrf2表達(dá)上調(diào)引起HO-1 含量增加，降低機(jī)體中自由基水平，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[26]。Li 等[10]發(fā)現(xiàn)，在高劑量GLP 400 mg/kg·d 干預(yù)下，2 型糖尿病小鼠體內(nèi)Nrf2 與HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著提高，增強(qiáng)了GSH-Px、SOD等抗氧化酶活力。因此，GLP 可激活Nrf2，促進(jìn)HO-1基因表達(dá)，降低自由基、ROS、過氧化硝酸鹽含量，提高機(jī)體抗氧化功能。同時(shí)，GLP 還能促進(jìn)NQO1基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，利用2.5 g/L GLP 處理成纖維細(xì)胞，顯著提高細(xì)胞中NQO1 蛋白表達(dá)量，CAT、SOD、GSH-Px等含量顯著增加，且ROS 與MDA 含量顯著減少，緩解細(xì)胞氧化損傷[6]。Hsieh 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，用10 mg/mL富含GLP 的靈芝乙醇提取物處理卵巢細(xì)胞72 h 后，細(xì)胞核中Nrf2 蛋白水平與穩(wěn)定性顯著提高，NQO1 蛋白表達(dá)水平提高2.4 倍，SOD 表達(dá)相較于對(duì)照組增加2.87倍，過氧化氫酶提高2.51 倍，說明GLP 具有上調(diào)Nrf2與NQO1基因表達(dá)、增加抗氧化酶含量的作用及提高卵巢細(xì)胞抗氧化能力。綜上所述，在Keap1-Nrf2/ARE抗氧化通路中，GLP 上調(diào)關(guān)鍵調(diào)控因子Nrf2基因表達(dá)，同時(shí)抑制Keap1基因表達(dá)，促進(jìn)Nrf2/ARE 通路下游HO-1和NQO1基因表達(dá)，提高HO-1、NQO1、SOD和GSH-Px 等抗氧化酶蛋白含量，清除過量自由基等，從而緩解氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的刺激，提高動(dòng)物抗氧化能力（圖1）。

圖1 GLP 對(duì)機(jī)體抗氧化功能的調(diào)控作用

2.2 GLP 增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性 機(jī)體中過多自由基使DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)受損或斷裂，引起細(xì)胞內(nèi)糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)變性，破壞生物膜系統(tǒng)，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響機(jī)體正常生命活動(dòng)[29]。GLP 可增加SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶含量與活性，清除羥基自由基、超氧陰離子和1,1-二苯基-2-三基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）等過量自由基，緩解機(jī)體氧化應(yīng)激[30-31]。在研究小鼠急性腎臟損傷中發(fā)現(xiàn)，添加靈芝多糖肽能提高SOD 活力，減少細(xì)胞色素C 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白含量，降低ROS 等自由基產(chǎn)生氧化損傷，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體應(yīng)激水平[32]。在肝臟氧化損傷恢復(fù)試驗(yàn)中添加黑靈芝多糖能提高機(jī)體GSH-Px 和CAT 活力，降低谷草轉(zhuǎn)氨 酶（Aspartate Transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（CerealthirdtranSaminase，GPT）和TG 含量，使肝索斷裂、核仁固縮與胞質(zhì)丟失恢復(fù)，緩解肝臟氧化損傷[33]。研究發(fā)現(xiàn)，過多ROS 刺激機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中添加GLP 后，巨噬細(xì)胞中ROS、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和IL-1β表達(dá)水平顯著下降，IL-10 含量上升，表明GLP 能抑制巨噬細(xì)胞向M1 表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其向M2 表型轉(zhuǎn)化，減少炎癥因子產(chǎn)生，增加抗炎因子生成，緩解炎癥反應(yīng)[34]。利用200 mg/kg BW 富含GLP 的靈芝提取物處理經(jīng)四氯化碳損傷小鼠發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中SOD、CAT 活力顯著提高，ROS 和超氧陰離子清除能力增強(qiáng)，壞死細(xì)胞和炎癥細(xì)胞減少，恢復(fù)了肝組織竇狀擴(kuò)張，維持肝臟正常機(jī)能[35]。在動(dòng)物體中，由于脂質(zhì)含有大量不飽和脂肪酞鏈，因此易被氧化產(chǎn)生過氧化物。研究發(fā)現(xiàn)，GLP 能與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS 結(jié)合，防止或減緩自由基攻擊細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[27]。將GLP 添加至大豆卵磷脂SPC 制備的脂質(zhì)體60 h 后，GLP 脂質(zhì)體僅產(chǎn)生8 ng MDA，是對(duì)照組的1/3，GLP 脂質(zhì)體產(chǎn)生的過氧化物是對(duì)照組的1/9，表明GLP 能有效延緩或阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力[21]?？傊珿LP 能提高SOD、GSH-Px、CAT 等抗氧化酶活性，降低自由基、MDA 與炎癥因子對(duì)機(jī)體的損傷，提高機(jī)體抗氧化能力，維持動(dòng)物細(xì)胞、組織和器官正常生理功能。

3 GLP 在動(dòng)物生產(chǎn)方面的應(yīng)用

3.1 單胃動(dòng)物 在家禽方面，GLP 增強(qiáng)GSH-Px 抗氧化酶活性，清除過氧化氫、過氧化脂質(zhì)（Lipid Peroxides，LPO）和MDA 等脂質(zhì)過氧化物，降低氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能，提高生產(chǎn)性能。研究顯示，富含GLP 的靈芝粉飼喂肉雞35 d 后，肝和脾內(nèi)GSH-Px 與谷胱甘肽還原酶含量與活力顯著增加，顯著降低肝內(nèi)LPO 和MDA 含量，表明GLP 能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能，緩解氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響[36]。GLP 還通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖與活性，提高免疫因子與抗體含量，增強(qiáng)動(dòng)物抗病能力，改善飼料利用率，進(jìn)而提高家禽生產(chǎn)性能[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)，利用0.2 mL GLP 飼喂鎘中毒雛雞68 d 后發(fā)現(xiàn)，雞胸腺與法氏囊中TNF-α、IL-1β、IL-6等因子含量顯著低于對(duì)照組，說明GLP 具有緩解雛雞鎘中毒、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力的作用[37]。

在豬方面，GLP 可增強(qiáng)公豬精子活力，顯著降低精子MDA 含量，提高SOD、CAT 和GSH-Px 的活性，保護(hù)頂體與質(zhì)膜不被氧化，提高公豬繁殖性能。在常溫保存液中添加濃度為0.4 mg/mL 的GLP 保存豬精子6 d后，精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率均顯著高于對(duì)照組[39]。GLP 還能降低炎癥因子分泌，提高機(jī)體中免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）含量，增強(qiáng)免疫力。利用0.2% GLP 飼喂育肥豬70 d 后發(fā)現(xiàn)，血清中炎癥因子IL-1β水平降低，IgG 濃度增加36.1%，表明GLP 具有提高機(jī)體免疫水平的作用[40]。利用800 mg/kg GLP 飼喂仔豬35 d 后，血清中IgG 和IL-2 濃度分別增加了33%和24%，白蛋白與球蛋白的比值顯著降低，改善了仔豬免疫力，提高了豬生產(chǎn)性能與肉品質(zhì)[41]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖-乳酸菌合生元飼喂產(chǎn)子母豬后發(fā)現(xiàn)，母豬總采食量提高13.18%，平均增重比對(duì)照組多4.0 kg/窩，仔豬腹瀉率降低8.07%，說明靈芝多糖-乳酸菌復(fù)合能夠維持腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，增加豬采食量，提高動(dòng)物平均日增重、存活率等生產(chǎn)性能[42]。

3.2 反芻動(dòng)物 在抗氧化方面，GLP 可增強(qiáng)機(jī)體SOD、GSH-Px 活性，清除MDA，緩解氧化應(yīng)激。在奶牛飼料中加入富含GLP 的菌草靈芝發(fā)酵菌質(zhì)37 d 后，發(fā)現(xiàn)血清中MDA 含量比對(duì)照組下降13.19%，機(jī)體SOD、GSH-Px 等酶活性提高，奶?？寡趸芰μ嵘齕43]。在免疫方面，GLP 還能促進(jìn)機(jī)體生成IgG、IgA、IgM 等免疫球蛋白，增強(qiáng)免疫力，增加產(chǎn)奶量，提高生產(chǎn)性能。利用3 kg 富含GLP 的鮮菌草與靈芝絲發(fā)酵菌質(zhì)替代等量青貯飼料飼喂處于泌乳中期的奶牛后，乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、非脂乳固體較對(duì)照組提高了2.24%、3.7%、1.9%、1.7%，奶牛血清中礦物質(zhì)元素、免疫蛋白、TG等生化指標(biāo)均處于正水平，改善了牛乳品質(zhì)，并提高了奶牛生產(chǎn)性能[44]。在調(diào)控瘤胃內(nèi)環(huán)境方面，飼料中添加200 g 富含GLP 的菌草靈芝菌糟飼喂1 d 后，瘤胃液中原蟲數(shù)量比對(duì)照組少1.11×106個(gè)/mL，改善了奶牛對(duì)能量以及氮源的利用率，增加了奶牛產(chǎn)奶量，提高了生產(chǎn)性能[45]。綜上所述，GLP 具有提高反芻動(dòng)物GSHPx、SOD 和CAT 等酶活性，清除MDA 等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，增加免疫因子含量，降低炎癥因子生成，調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化與免疫機(jī)能。此外，GLP 還可調(diào)節(jié)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，提高奶牛的產(chǎn)奶量以及延緩泌乳中期產(chǎn)奶量下降的作用。

3.3 水產(chǎn)動(dòng)物 GLP 可提高水產(chǎn)動(dòng)物CAT、SOD 等抗氧化酶、酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）和堿性磷酸酶（Alkaline Ahosphatase，AKP）活性，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝，提高生產(chǎn)性能。Liu 等[46]在研究GLP 對(duì)鯉魚肝損傷恢復(fù)中發(fā)現(xiàn)，體外肝細(xì)胞經(jīng)0.6 mg/mL GLP 處理后，SOD、GSH-Px 和CAT 含量較對(duì)照組顯著提高，MDA、AST 與GPT 含量顯著降低，表明GLP 能提高肝細(xì)胞抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)肝臟。研究發(fā)現(xiàn)，ACP 與AKP 參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成和生長(zhǎng)等代謝活動(dòng)，在飼料中添加2.5 g/kg GLP 飼喂羅氏沼蝦90 d 后，與對(duì)照組相比，羅氏沼蝦肌肉、肝胰腺中AKP 與ACP 含量顯著增加，特定生長(zhǎng)速率提高了0.38%/d，采食量與蛋白質(zhì)效率比也顯著提高，體長(zhǎng)、體重均值分別增加1.22 cm 和0.93 g，說明GLP 能加強(qiáng)機(jī)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，提高生產(chǎn)性能[47]。此外，用含1.5 g/kg GLP 的日糧飼喂羅氏沼蝦60 d 后，羅氏沼蝦存活率相對(duì)于對(duì)照組提高9.35%，嗜水氣單胞菌感染死亡率顯著降低，比生長(zhǎng)速率顯著提高，說明GLP 在機(jī)體內(nèi)能作為潛在能量來源，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，維持機(jī)體健康[48]。

4 小結(jié)與展望

GLP 具有提高機(jī)體抗氧化酶活性、清除自由基、降低炎性細(xì)胞因子分泌的作用，主要表現(xiàn)在2 個(gè)方面。①在Keap1-Nrf2/ARE 通路中：GLP 上調(diào)Nrf2基因表達(dá)，下調(diào)Keap1基因表達(dá)，抑制Nrf2 與Keap1 結(jié)合，促進(jìn)Nrf2 釋放進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而上調(diào)下游HO-1和NQO1基因，提高抗氧化酶含量與活力，清除自由基。②GLP可通過上調(diào)機(jī)體抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)，提高內(nèi)源性酶含量與活力，從而清除多余自由基，緩解氧化損傷；GLP 還可以降低ROS 對(duì)機(jī)體的氧化作用，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進(jìn)程。目前，GLP 作為優(yōu)質(zhì)飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)，有效提高機(jī)體免疫力、生產(chǎn)性能、抗應(yīng)激與抗氧化能力；還可作為輔助藥物緩解肝臟、腎臟等器官損傷，在動(dòng)物氧化損傷治療方面具有潛力。此外，GLP 作為抗氧化添加劑在延長(zhǎng)畜禽精子保存時(shí)間上具有良好效果。但對(duì)于GLP 是否參與更多抗氧化通路尚未明確，還需進(jìn)一步深入探究。