李丹，謝偉，于寧，郁瓊麗，施亞茹，張穎超，林灼鋒

溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

非諾貝特（fenofibrate, FF）是治療高脂血癥的常用藥物，主要通過抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, VLDL）和甘油三脂（triglyceride, TG）表達(dá)，提高高密度脂蛋白（high-density lipoprotein, HDL）水平發(fā)揮降脂作 用[1-2]。早期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F能夠激活過氧物酶體增殖物激動(dòng)受體α（peroxisome proliferatoractivated receptor-α, PPARα），并促進(jìn)其下游脂蛋白脂肪酶相關(guān)基因的表達(dá)[3-5]。

成纖維細(xì)胞生長因子21（fibroblast growth factor 21, FGF21）是一種主要由肝臟表達(dá)分泌的代謝激素，具有調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及胰島素敏感性的多效性[6]。FGF21已被證明可以通過調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝來調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[7-9]。FGF21在禁食期間被報(bào)道為PPARα多效性作用的介導(dǎo)者[10]， VERNIA等[11]闡明了機(jī)體肝臟FGF21和PPARα的表達(dá)相關(guān)性，并證明了PPARα通過激活JNK信號通路刺激FGF21的表達(dá)。然而，F(xiàn)F是否通過FGF21調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝，仍有待于進(jìn)一步探究。

本研究選取FGF21基因缺失小鼠及同窩野生型小鼠進(jìn)行高脂飲食（high-fat diet, HFD）喂養(yǎng)誘導(dǎo)其形成肥胖小鼠模型，觀察FF改善肥胖小鼠機(jī)體脂質(zhì)代謝的作用，探討FGF21基因是否介導(dǎo)FF改善肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)代謝。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：8周齡SPF級雄性C57BL/6J FGF21基因缺失（FGF21 KO）小鼠及C57BL/6J WT小鼠由香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫維持在21～23 ℃，濕度40%～60%，12 h/12 h自然光交替照明，自由飲水飲食。

1.1.2 試劑與儀器：高脂飼料購于美國Open Source Diets公司；HE染色相關(guān)試劑購于北京索萊寶有限公司；FF及油紅染色相關(guān)試劑購于德國Sigma-Aldrich公司；TRIzol購于大連Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，One-Step RT-PCR試劑盒購于美國Thermo Scientific公司；FGF21及脂聯(lián)素（Adiponectin）ELISA試劑盒購于美國ImmunoDiagnostics Limited公司；TG和總膽固醇（total cholesterol, TC）檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司。定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司；熒光正置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：取FGF21基因缺失 （FGF21 KO）小鼠及同窩C57BL/6J野生型（WT）小鼠各10只，隨機(jī)分為4組，分別為：野生型對照組（WT+HFD+CTL組）、野生型FF治療組（WT+HFD+FF組）、FGF21基因敲除對照組（FGF21 KO+HFD+CTL組）、FGF21 基因敲除FF治療組（FGF21 KO+HFD+FF組）。給予4組小鼠HFD喂養(yǎng)4周，同時(shí)治療組以FF（150 mg/kg） 灌胃處理，對照組以相同體積的注射用水灌胃處理。4周后，處死小鼠，收集小鼠血清樣本、肝臟、皮下脂肪等組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HE染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化：肝臟組織樣本取出后，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等操作后，切取5 μm厚的肝臟組織切片，制備成石蠟切片。切片干燥后，經(jīng)脫蠟、乙醇梯度水化，通過HE染色，最后使用中性樹脂封片，鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 油紅O染色觀察肝臟組織脂質(zhì)堆積情況：肝臟組織樣本取出后，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，OCT包埋，切取5 μm厚的肝臟組織冰凍切片。將切片放入預(yù)冷的80%丙酮中固定10 min；晾干后用純化水洗滌3次；切片滴加油紅O工作液染色6 min；純化水漂洗，依次置入60%異丙醇溶液I、II中各洗脫3 min；再次使用純化水漂洗；水性封片劑封片、鏡檢。

1.2.4 ELISA法檢測FGF21的水平：取小鼠血清稀釋2倍，根據(jù)廠家提供的說明書，采用定量夾心ELISA法，于450 nm處檢測樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.2.5 ELISA法檢測Adiponectin的水平：取小鼠血清稀釋400倍，按照廠家提供的說明書，于450 nm 處檢測樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.2.6 qRT-PCR檢測目的基因表達(dá)：使用TRIzol試劑提取肝臟及皮下脂肪組織中的RNA，超微量分光光度計(jì)檢測組織RNA含量。根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)小鼠PPARα、FGF21、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白Srebp-2、乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl coenzyme A carboxylase alpha, Acaca）、乙酰輔酶A羧化酶β（acetyl coenzyme A carboxylase beta, Acacb）、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G亞家族成員5（ATP-binding cassette transporter subfamily G member 5, ABCG5）、ABCG8、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alphahydroxylase, Cyp7a1）、PPARγ、Adiponectin的mRNA特異性引物，以GAPDH為內(nèi)參（由美國Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計(jì)合成，見表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、1 μL引物（上、下游各0.5 μL）、3 μL反應(yīng)緩沖液，以及1 μL待測樣品cDNA。PCR反應(yīng)體系為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s，反復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FF對HFD喂養(yǎng)的WT小鼠和FGF21 KO小鼠機(jī)體組分的影響 結(jié)果表明，無論是WT小鼠還是FGF21 KO小鼠，在HFD飼養(yǎng)基礎(chǔ)上使用FF治療均能顯著抑制HFD引發(fā)的小鼠體質(zhì)量增加，同時(shí)顯著增加小鼠的肝臟、腎臟比重，但小鼠的皮下脂肪、腎周脂肪、附睪脂肪比重顯著降低（P＜0.05）。此外，F(xiàn)F給藥可明顯降低WT小鼠的棕色脂肪比重（P＜0.01），而對FGF21 KO小鼠的棕色脂肪比重?zé)o影響（P＞0.05）。見表2。

表2 FF對高脂飲食的WT小鼠和FGF21 KO小鼠機(jī)體組分的影響（每組n=5）

2.2 FF對HFD喂養(yǎng)小鼠體內(nèi)PPARα和FGF21水平的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，在HFD喂養(yǎng)條件下，與對照組相比，F(xiàn)F處理顯著上調(diào)WT小鼠肝臟組織的PPARα及FGF21 mRNA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在FGF21 KO小鼠中，F(xiàn)F誘發(fā)的該效應(yīng)在一定程度上減弱，見圖1。此外，F(xiàn)F處理刺激WT小鼠血清FGF21水平顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖2。

圖1 各組小鼠肝臟組織PPARα和FGF21的mRNA表達(dá)水平

圖2 各組小鼠血清中FGF21含量

2.3 敲除FGF21減弱FF對HFD喂養(yǎng)小鼠血脂的改善作用 在HFD喂養(yǎng)條件下，F(xiàn)F給藥明顯降低WT小鼠和FGF21 KO小鼠的血清TG水平（P＜0.05），然而FGF21 KO小鼠的TG下降幅度明顯小于WT小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，F(xiàn)F給藥明顯下調(diào)HFD喂養(yǎng)的WT小鼠血清TC含量（P＜0.05），而FF引發(fā)的降低血清TC的作用在FGF21基因缺失后被完全抑制，見圖3。

圖3 各組小鼠血清TG和TC的含量

2.4 敲除FGF21減弱FF改善HFD喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的作用 組織形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果顯示，HFD飼養(yǎng)4周后，對照組WT小鼠的肝臟組織均出現(xiàn)圓形中空的空泡。與對照組WT小鼠相比，在FF給藥4周后，肝臟組織的空泡數(shù)量明顯減少，肝細(xì)胞排列整齊；然而在FGF21 KO小鼠中，F(xiàn)F給藥處理后仍然可見較多的大空泡，見圖4。與組織形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果染色一致，油紅O染色結(jié)果顯示，HFD飼養(yǎng)4周后，對照組小鼠的肝臟組織出現(xiàn)不同密度的紅色脂滴；與對照組WT小鼠相比，在FF處理4周后，小鼠肝臟中的脂滴數(shù)量明顯減少；但FGF21 KO小鼠經(jīng)FF處理后，小鼠肝臟組織的脂滴數(shù)量則無明顯變化。見圖5。

圖4 HE染色評價(jià)肝組織形態(tài)學(xué)改變（箭頭所示為肝組織空泡，×200）

圖5 油紅染色評價(jià)肝組織脂質(zhì)堆積情況（×200）

2.5 敲除FGF21減弱FF加速肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用 與HFD喂養(yǎng)的WT小鼠相比，給予FF治療4周后，小鼠肝臟脂肪酸合成基因Acaca的mRNA表達(dá)水平無明顯變化，見圖6A。而小鼠肝臟Acacb的表達(dá)則明顯增加（P＜0.01）；然而在FGF21基因敲除后，Acaca的表達(dá)無明顯變化，而FF處理引發(fā)的Acacb上調(diào)幅度在一定程度被減弱，見圖6B。

在肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控方面，與HFD喂養(yǎng)的WT小鼠相比，F(xiàn)F處理4周后，小鼠肝臟組織中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子ABCG5和ABCG8的mRNA表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；然而在FGF21 KO小鼠中，F(xiàn)F對小鼠肝臟組織ABCG8的表達(dá)無明顯影響，但FF誘導(dǎo)的ABCG5表達(dá)增加現(xiàn)象在FGF21基因敲除后被顯著抑制（P＜0.01），見圖6C、圖6D。

在膽固醇合成及分解代謝方面，給予FF處理后，Srebp-2 mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）；而參與膽汁酸代謝和分泌的關(guān)鍵基因Cyp7a1 mRNA表達(dá)則明顯增加（P＜0.05）；然而在FGF21基因缺失后，F(xiàn)F引發(fā)的肝臟Srebp-2和Cyp7a1的表達(dá)變化幅度被明顯抑制（P＜0.01、P＜0.05）。見圖6E、圖6F。

圖6 qRT-PCR檢測各組小鼠肝臟組織中Acaca、Acacb、ABCG5、ABCG8、Srebp2、Cyp7a1的mRNA水平

2.6 敲除FGF21顯著抑制FF誘導(dǎo)的PPARγ和 Adiponectin表達(dá)上調(diào) qRT-PCR結(jié)果顯示，在HFD喂養(yǎng)條件下，F(xiàn)F給藥明顯上調(diào)WT小鼠皮下脂肪組織的PPARγ及Adiponectin mRNA水平（P＜0.05），同時(shí)也顯著增加小鼠血清的Adiponectin循環(huán)水平（P＜0.01）。然而FGF21基因敲除后，F(xiàn)F處理引發(fā)的肝臟PPARγ和Adiponectin上調(diào)幅度均被顯著抑制（P＜0.05），血清Adiponectin上調(diào)幅度也被顯著抑制（P＜0.05）。見圖7。

圖7 qRT-PCR檢測各組小鼠皮下脂肪組織中PPARγ、Adiponectin mRNA水平及ELISA檢測各組小鼠血清中Adiponectin的變化

3 討論

FGF21是一種應(yīng)激誘導(dǎo)激素，通過FGF受體1（FGFR1）和β-klotho構(gòu)成的異二聚體受體復(fù)合物，在調(diào)節(jié)能量平衡和糖脂穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[12-14]。 作為FGFs家族非典型成員，F(xiàn)GF21能夠通過自分泌作用對肝臟組織進(jìn)行脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[15-16]。既往研究表明給嚙齒動(dòng)物或非人靈長類動(dòng)物服用FGF21可減輕與肥胖有關(guān)的代謝并發(fā)癥，比如減少脂肪量、緩解高血糖、改善胰島素抵抗[17-18]，減輕血脂異常、心血管疾病和非酒精性脂肪性肝炎的病變情 況[17]。

FF是一種纖維酸衍生物，用于治療對非藥物治療無反應(yīng)的患者的嚴(yán)重高甘油三酯血癥和混合性脂代謝紊亂，改善血脂異?；颊叩难剑ㄌ貏e是TG和HDL水平）[11，19]，F(xiàn)F通過激活PPARα發(fā)揮調(diào)脂作用[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21通過改善小鼠白色脂肪組織功能障礙，對FF介導(dǎo)的肥胖小鼠全身葡萄糖代謝的改善起重要作用[22]。然而FF與FGF21在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面的相關(guān)性研究少有報(bào)道，F(xiàn)GF21是否介導(dǎo)FF發(fā)揮其改善肝臟脂質(zhì)代謝的作用有待于進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F刺激FGF21的循環(huán)水平增加，提示FGF21在FF改善機(jī)體脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用。FF治療后可顯著改善小鼠脂質(zhì)代謝，表現(xiàn)為改善小鼠血脂水平，減輕HFD引發(fā)的肝臟脂質(zhì)沉積狀況。值得注意的是，F(xiàn)F對FGF21 KO小鼠的保護(hù)作用大大減弱。此外，F(xiàn)F處理顯著抑制膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白Srebp-2的表達(dá)，上調(diào)脂肪酸氧化基因Acacb，膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)基因ABCG5和ABCG8、膽汁酸代謝基因Cyp7a1的表達(dá)，這表明在HFD喂養(yǎng)條件下，F(xiàn)F給藥可能抑制膽固醇合成，同時(shí)可能有助于促進(jìn)小鼠肝臟脂質(zhì)氧化代謝，加速脂質(zhì)利用，進(jìn)而減輕肝臟脂質(zhì)沉積；而FGF21基因敲除后，F(xiàn)F對機(jī)體脂質(zhì)代謝的改善作用明顯減弱。以上結(jié)果提示，F(xiàn)F發(fā)揮抗脂肪肝的生物學(xué)作用至少部分是通過上調(diào)FGF21的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。Adiponectin在FGF21調(diào)控糖脂代謝過程中扮演重要角色[8]，它是PPARγ的下游效應(yīng)物，并且是PPARγ激動(dòng)劑噻唑烷二酮發(fā)揮胰島素增敏和保護(hù)血管等作用的重要介質(zhì)[23-25]。那么，F(xiàn)GF21調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝是否與Adiponectin相關(guān)有待于進(jìn)一步探索。本研究檢測了各組小鼠機(jī)體的PPARγ和Adiponectin的表達(dá)水平，結(jié)果顯示FF刺激WT小鼠體內(nèi)PPARγ和Adiponectin水平明顯上調(diào)，推測是由于FF刺激肝組織合成FGF21并將其分泌到循環(huán)系統(tǒng)，與脂肪組織中的受體結(jié)合從而激活PPARγ信號通路，進(jìn)而上調(diào)Adiponectin的表達(dá)和分泌。有研究表明，脂肪組織在介導(dǎo)FGF21發(fā)揮降低TG作用方面是必需的[26]，Adiponectin缺乏導(dǎo)致FGF21對HFD誘導(dǎo)的高TG血癥的抑制作用受損[7]。與文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果一致，本研究結(jié)果表明：FGF21基因缺失后，F(xiàn)F刺激PPARγ及Adiponectin表達(dá)增加的現(xiàn)象被顯著抑制，同時(shí)，F(xiàn)F引發(fā)的降低血清TG的作用也被明顯減弱，提示Adiponectin在FGF21介導(dǎo)FF發(fā)揮抗脂肪肝作用中扮演重要角色。

綜上所述，在HFD喂養(yǎng)條件下，F(xiàn)F通過激活PPARα通路刺激FGF21表達(dá)增加，后者可能通過間接或直接的方式促進(jìn)肝臟組織中脂肪酸燃燒來發(fā)揮其改善機(jī)體肝臟脂質(zhì)代謝的生物學(xué)效應(yīng)。