張燕 彭凱悅 馬向麗 王輝 另如貴 任健

摘? 要：利用水培法研究外源NO對鋁脅迫（0.1 mmol/L）下生長的紫花苜蓿（WL525HQ）幼苗形態(tài)、生理特征的影響，揭示NO緩解紫花苜蓿鋁毒的生理機(jī)制。結(jié)果表明：鋁脅迫抑制了幼苗的生長，表現(xiàn)為株高、根長、葉面積、地上和地下部生物量顯著降低。另一方面，降低了葉片中脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性，提高了根系脯氨酸含量（P<0.05）。施用外源NO后，紫花苜蓿在形態(tài)和生理方面對鋁脅迫的響應(yīng)發(fā)生了一些改變，且改變與NO的濃度有關(guān)。其中，低濃度NO緩解了鋁脅迫對苜蓿幼苗主根伸長的抑制作用;中濃度NO則解除了鋁脅迫對株高、根系表面積和體積的抑制作用，提高了地上和地下部生物量;高濃度NO顯著地提高了苜蓿地上部和地下部脯氨酸含量和SOD活性。綜上所述，外源NO能通過積累脯氨酸、增加SOD活性等方式，緩解鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的抑制作用，促進(jìn)地上部和地下部的物質(zhì)積累。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿;脯氨酸;硝普鈉;超氧歧化酶

中圖分類號：S541????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Impacts of Exogenous Nitric Oxide on Growth of Alfalfa Seedlings Exposed to Aluminum Stress

ZHANG Yan1， PENG Kaiyue1，2*， MA Xiangli1， WANG Hui1， LING Rugui1， REN Jian*

1. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China; 2. Gucheng Animal Husbandry and Veterinary Center Station， Wuxiang， Shanxi 046302， China

Abstract： The effects of exogenous nitric oxide （NO） application on the morphological and physiological characteristics of alfalfa （WL525HQ） seedlings under aluminum stress （0.1 mmol/L） were studied through hydroponics to reveal the physiological mechanism of NO alleviating aluminum toxicity of alfalfa. The results indicated that aluminum stress inhibited the growth of alfalfa seedlings shown by the significant decrease in plant height， root length， leaf area， aboveground and belowground biomass. Free proline content and superoxide dismutase （SOD） activity in the leaves were significantly reduced， whereas proline in the roots was significantly increased （P<0.05）. Exogenous NO application affected its morphological and physiological responses to aluminum stress， and it was related to the concentration applied. Low concentration of exogenous NO alleviated the inhibiting effect of aluminum stress on the main root length. Medium concentration increased plant height， surface area and volume of root system under aluminum stress， which led to increases of above and below ground biomass. High concentration significantly increased free proline and SOD activity. In summary， exogenous NO alleviates the inhibitory effect of aluminum stress on the growth of alfalfa seedlings through processes like free proline accumulation and SOD， hence， contribute to enhancement of above and below ground biomass.

Keywords： Medicago sativa; free proline; sodium nitroprusside （SNP）; superoxide dismutase （SOD）

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.024

鋁元素廣泛分布在土壤之中，當(dāng)土壤呈堿性時(shí)，鋁元素主要以Al（OH）4?形式存在;當(dāng)土壤呈中性時(shí)，以難溶的Al（OH）3形態(tài)存在;當(dāng)土壤酸化后，以Al（H2O）63+形式存在，這時(shí)易溶于土壤中[1]。適量的鋁對植物的生長具有一定的促進(jìn)作用，如低濃度的鋁處理（1 mmol/L和10 mmol/L）可以提高大豆的發(fā)芽率、鮮重、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，降低電導(dǎo)率，增強(qiáng)抵抗逆境的能力[2]。但毫摩爾水平的Al3+對某些植物產(chǎn)生毒害作用，酸性土壤溶液中A13+濃度約為0.01～0.10 mmol/L，會導(dǎo)致某些植物根系和地上部分的莖和葉片生長受阻甚至停止，降低植物吸收水分和營養(yǎng)的能力，最終抑制植物生長，導(dǎo)致產(chǎn)量降低[3]。我國南方酸性紅壤分布廣泛，鋁毒害已經(jīng)是南方酸性土壤地區(qū)農(nóng)作物生長發(fā)育的主要限制因素之一，引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，有關(guān)鋁對植物的毒害研究，主要集中在小麥、大豆、白苦瓜等農(nóng)作物[4-6]，而牧草方面研究較少。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是優(yōu)質(zhì)的多年生豆科（Leguminosae）牧草，在我國廣泛種植，因其適口性好、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高，營養(yǎng)成分豐富等特點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”。當(dāng)土壤中Al3+濃度高于0.10 mmol/L時(shí)，作為超敏感植物的紫花苜蓿種子發(fā)芽率降低，幼苗生長緩慢，水分和營養(yǎng)的吸收降低，使其生長受到一定程度的抑制，最終導(dǎo)致生物產(chǎn)量與種子產(chǎn)量的減少[7]。在鋁毒脅迫下天藍(lán)苜蓿（Medicago lupulina ）根瘤菌的SOD酶活性一定程度減小后緩慢上升，而CAT、POD和GR酶活性隨鋁濃度增大顯著下降[8]。當(dāng)土壤pH為6.1～6.5時(shí)，紫花苜蓿生長開始受限制，根瘤菌的繁殖率和存活率下降;當(dāng)土壤pH低于6.0時(shí)，紫花苜蓿生長受嚴(yán)重抑制[9]。

在我國南方草地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，多采用撒施石灰對酸性土壤進(jìn)行改良，雖效果好，但成本大，改良面積有限，僅對土壤表層進(jìn)行改良，土壤深處仍呈酸性，且長期使用石灰會導(dǎo)致土壤板結(jié)，有必要進(jìn)一步開展減輕鋁毒的機(jī)理研究。NO作為生物體內(nèi)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要信號分子，具有抗氧化、阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、保護(hù)植株免受超氧化損傷、增強(qiáng)細(xì)胞中抗氧化酶活性，緩解鎘、銅等金屬對植物的毒害、對植物種子萌發(fā)和幼苗生長起調(diào)控作用[10-11]。硝普鈉（sodium nitroprusside， SNP）作為外源NO，可誘導(dǎo)植物根尖積累ABA，且活性氧可以加強(qiáng)其作用效果。研究發(fā)現(xiàn)，SNP可以減輕鹽脅迫對植物葉片的氧化損傷[12]，增強(qiáng)植物耐鹽性[13]，延緩鎘毒害下水稻葉片葉綠素和蛋白的下降，降低鎘含量[14]。因此，探索不同濃度SNP對酸鋁條件下紫花苜蓿幼苗生長狀況和內(nèi)在因素及其作用機(jī)理的影響，對緩解紫花苜蓿的鋁毒具有重要的意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗(yàn)材料選用云南引進(jìn)的紫花苜蓿品種‘WL525HQ，該品種抗逆性強(qiáng)，在產(chǎn)量、營養(yǎng)成分含量和生長特性等方面都有上好的表現(xiàn)。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 選取大小、形狀、色澤一致且飽滿的種子，用0.1% HgCl溶液消毒15 min后沖洗干凈，移栽到含有蛭石的育苗盆中，放入人工氣候箱中培育，每3 d澆1次蒸餾水。人工氣候箱白天溫度為（25±1）℃，夜晚溫度為（20±1）℃，每天光照12 h，黑暗12 h，光強(qiáng)為4000 lx，濕度為70%。待種子發(fā)芽后，每3 d補(bǔ)充1次Hoagland營養(yǎng)液，待紫花苜蓿幼苗高度生長到10 cm左右開始脅迫處理。

試驗(yàn)共有5個(gè)處理，即（1）對照（CK）：0 mmol/L Al+0 mmol/L SNP;（2）Al脅迫處理（Al）：0.1 mmol/L Al（pH=4.5）+0 mmol/L SNP;（3）高濃度SNP處理（H）：0.1 mmol/L Al+ 0.5 mmol/L SNP;（4）中濃度SNP處理（M）：0.1 mmol/L Al+0.2 mmol/L SNP;（5）低濃度SNP處理（L）：0.1 mmol/L Al+0.05 mmol/L SNP，每個(gè)處理重復(fù)3次。每3 d澆灌1次，每次澆灌以根系全部浸沒為原則。處理1個(gè)月后，分別測定地上部分和地下部分的形態(tài)指標(biāo)及生理生化指標(biāo)。

1.2.2? 測定指標(biāo)與方法? 形態(tài)指標(biāo)：將植株整株洗凈后，用直尺測定株高和根長，然后將根、莖、葉分離，置于105 ℃烘箱殺青15 min后65 ℃烘干置恒重，測定干重。用紙樣稱重法測定葉面積。葉含水量=（葉片鮮重–葉片干重）/葉片鮮重×100%。

根系分析：采用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)掃描儀測定根系總根長、根系的總表面積、根系的平均直徑、根系的總體積等。

常規(guī)生理指標(biāo)：葉綠素含量測定參考Inskeep等[15]的方法;超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照孫群等[16]的方法;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[17]。游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮法[17]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。使用Microsoft Office Excel 2003軟件和OriginPro 2017軟件制作相關(guān)圖表。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 對紫花苜蓿幼苗生長的影響

與CK相比，Al脅迫顯著抑制了紫花苜蓿地上部分和地下部分的生長，表現(xiàn)為株高、根長、葉面積、地上部干重和根干重均明顯下降（P< 0.05）（表1）。在外源NO的作用下，鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗地上部和地下部的抑制作用發(fā)生了一些改變。施加中、高濃度NO后，株高較Al脅迫分別增加了30.0%、23.3%，尤其是中濃度的NO對緩解鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗株高的抑制作用最明顯。就根長而言，低濃度的NO處理顯著減輕了鋁脅迫的抑制作用（P<0.05），使根長增加了83.1%。對地上部鮮重而言，與Al脅迫相比，施加外源NO影響不顯著（P>0.05）。對地上部干重和根干重而言，中濃度NO處理后，與Al脅迫相比，分別提高了80.0%和100.0%（P<0.05），表明中濃度NO能夠緩解Al對紫花苜蓿幼苗地上部和地下部生長的抑制作用。另外，與Al脅迫相比，不同濃度NO處理下紫花苜蓿幼苗葉面積并無明顯變化（P>0.05）。

2.2? 對紫花苜蓿幼苗根系形態(tài)指標(biāo)的影響

與CK相比，Al脅迫對紫花苜蓿幼苗的總根長、根系總表面積、平均直徑和總體積的影響均不顯著（P>0.05）（表2），表明0.1 mmol/L Al脅迫處理對紫花苜蓿根系形態(tài)無明顯的影響。施加不同濃度的外源NO對紫花苜蓿幼苗根系的生長影響不同。其中，低濃度NO對紫花苜蓿幼苗總長度、總表面積、平均直徑均與Al處理無顯著性差異（P>0.05）。與Al處理相比，中濃度NO促進(jìn)了根系發(fā)育。

2.3? 對葉片葉綠素含量的影響

從圖1可見，與CK相比，Al脅迫對紫花苜蓿的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量的影響不顯著（P>0.05）。相反，外源施加不同濃度的NO后，顯著降低了紫花苜蓿的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量（P<0.05）;就葉綠素a、b和總?cè)~綠素而言，施加中濃度的NO的葉綠素含量均顯著高于其他兩個(gè)處理（P<0.05）（圖1）。

2.4? 對紫花苜蓿葉片和根系脯氨酸含量的影響

從圖2可見，Al和外源性NO對紫花苜蓿葉片和根系的脯氨酸含量都產(chǎn)生了顯著的影響（P<0.05），只是葉片和根系中脯氨酸的變化趨勢不同。在葉片中，與CK相比，Al顯著降低了葉片中的Pro含量（P<0.05），相反，施加中、高濃度NO后Pro含量較CK顯著增加（P<0.05）。就根系而言，Al脅迫處理中的Pro含量顯著高于CK（P<0.05）。施加低、中濃度NO后顯著降低了根系中的Pro含量，施加高濃度NO，根系中的Pro含量又顯著增加。

2.5? 對紫花苜蓿葉片和根系中丙二醛含量的影響

從圖3可見，與CK相比，低濃度Al脅迫均顯著提高了紫花苜蓿葉片和根系中MDA含量（P<0.05），尤其是施加NO后葉片的MDA含量增加明顯（P<0.05）;在根系中，與CK相比僅低濃度NO顯著提高了MDA含量。

2.6? 對紫花苜蓿葉片和根系中超氧化物歧化酶的影響

從圖4可見，Al脅迫下，紫花苜蓿葉片和根系中SOD活性變化趨勢不一致。在葉片中，與CK相比，Al脅迫顯著降低了SOD活性（P<0.05），而根系中SOD活性變化不顯著（P>0.05）。在高濃度NO處理下，紫花苜蓿葉片和根系中的SOD活性均得到了提高，顯著高于Al脅迫處理，說明施加高濃度NO增強(qiáng)了紫花苜蓿植株的抗氧化能力，有利于緩解鋁毒的不利影響。

3? 討論

3.1? 鋁脅迫與外源NO對紫花苜蓿幼苗生長的影響

本試驗(yàn)中，鋁脅迫明顯抑制了紫花苜蓿幼苗地上部分和地下部分的生長，進(jìn)一步證實(shí)Pan等[18]的研究。不過，由于植物耐鋁脅迫的能力不同，香樟等植物中并沒有觀察到鋁的抑制作用[19]。在植物的地下部，根系是鋁脅迫作用的最初靶位，其變化對于了解植物受到的酸鋁脅迫及其相應(yīng)緩解機(jī)制極其重要。研究發(fā)現(xiàn)，酸鋁脅迫顯著降低了紫花苜蓿幼苗的根系長度和干重，類似的抑制作用在蕎麥中也有發(fā)現(xiàn)[20]，原因可以歸結(jié)于ATP合成酶活性的降低[21]、細(xì)胞膜的破壞[22]、根系活力的下降[23]。不過，施加外源NO之后，鋁的抑制作用發(fā)生了改變，據(jù)張啟明等[24]報(bào)道這種變化是植物抵御逆境的表現(xiàn)。

對根系總表面積和總體積來說，高濃度NO與中濃度NO處理之間差異顯著，表明NO濃度過高抑制了植物根系的吸收和在土壤中的活動。這可能是因?yàn)橥庠碞O本身是一種抗氧化劑，它具有清除超氧陰離子ROS的作用，可通過調(diào)節(jié)超氧化物的形成同時(shí)抑制脂質(zhì)過氧化物來保護(hù)植物免受外界環(huán)境脅迫的影響，但外源NO濃度過高反而會促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的形成從而抑制根系形態(tài)的生長[25]。

3.2? 鋁脅迫與外源NO對紫花苜蓿生理指標(biāo)的影響

就葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素而言，鋁脅迫對它們的影響不顯著，這與張慧敏等[26]在對鋁脅迫下蠶豆葉綠素含量影響的研究結(jié)果一致，據(jù)錢蓮文等[27]的研究，植物中吸收的大部分Al3+積累在根系，轉(zhuǎn)移到地上部分較少，使得葉綠素合成受到的影響較小。不過與袁世力等[28]的結(jié)果不一致，可能是試驗(yàn)材料對酸鋁的抗性不同、處理時(shí)間不同所導(dǎo)致。施加高、中、低濃度的NO均降低了葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量，其變化機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

脯氨酸不僅能保持細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外的滲透勢[29]，而且能減輕脅迫下細(xì)胞液中酸中毒現(xiàn)象[30]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Al脅迫下地上部分和地下部脯氨酸的積累規(guī)律不一致，葉片中的脯氨酸含量降低，相反地下部顯著增加，這與根系直接吸收鋁離子有關(guān)，據(jù)Khan等[31]報(bào)道脯氨酸的積累有利于增加植物對鋁的抗性;另外，葉片為新物質(zhì)的合成提供氮素和碳架，使得脯氨酸含量降低[32]。

NO的施用進(jìn)一步改變了Al脅迫下脯氨酸在地上部、地下部的分布特點(diǎn)，特別是在高濃度NO作用下，地上部分和地下部分中脯氨酸含量進(jìn)一步提高，表明NO能促進(jìn)植株中脯氨酸的積累，進(jìn)而解除鋁的毒害作用。認(rèn)為Al脅迫下，苜蓿內(nèi)脯氨酸大量積累，積累的脯氨酸作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細(xì)胞酸堿性、解除氨毒以及能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等的作用。

植物逆境下產(chǎn)生的活性氧，會破壞植物功能分子，引起膜脂過氧化，增加丙二醛（MDA）含量等。本試驗(yàn)中，鋁脅迫下葉片和根系中MDA含量均升高，只是根中的變化不明顯。NO的作用下，葉片、根中丙二醛含量有進(jìn)一步升高的趨勢，該結(jié)果與嚴(yán)紹裕[33]的研究結(jié)果一致。

鋁脅迫對苜蓿地上部分和地下部分中超氧化物歧化酶（SOD）的活性影響有所不同，其中葉片中SOD活性顯著降低，而根系中SOD受到的影響不明顯。不過，NO的施用改變了Al脅迫對SOD活性的影響，尤其是高濃度下SOD活性顯著增加。當(dāng)植物受到外界因素脅迫產(chǎn)生過量的活性氧時(shí)，超氧化物歧化酶（SOD）會清除這些活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[34]。表明紫花苜蓿在鋁脅迫下，NO可以促進(jìn)植物釋放出SOD，進(jìn)而促進(jìn)解除鋁脅迫產(chǎn)生的一系列毒害作用。

本試驗(yàn)是在水培液中進(jìn)行的，與紫花苜蓿在大田的響應(yīng)還是有一定的差異，因?yàn)榇筇锷a(chǎn)受多種因素的影響，植物對鋁脅迫的響應(yīng)可能不如水培實(shí)驗(yàn)敏感。

綜上所述，鋁脅迫降低了株高、根長、葉面積、地上和地下部生物量，以及葉片中脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性，相反，提高了根系脯氨酸含量。施用外源NO后，紫花苜蓿在形態(tài)和生理方面對鋁脅迫的響應(yīng)發(fā)生了一些改變。其中，低濃度NO緩解了鋁脅迫對苜蓿幼苗主根伸長的抑制作用;中濃度NO則解除了鋁脅迫對株高、根系表面積和體積的抑制作用，提高了地上和地下部生物量。高濃度NO顯著地提高了苜蓿地上部和地下部中脯氨酸含量和SOD活性?？傊?，外源NO能通過積累脯氨酸、增加SOD活性等方式，緩解鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的抑制作用，促進(jìn)地上部和地下部的物質(zhì)積累。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)